江淮流域杂草稻叶绿体DNA的籼粳分化

 为了探明江淮流域杂草稻的细胞质来源,根据水稻叶绿体DNA ORF100（Open Reading Frame 100）序列在籼粳间存在69 bp差异的特征,设计了InDel标记cpDNA69。利用该标记对2个分别以籼稻和粳稻为母本的F2群体、22份栽培稻（Oryza sativa L.）、3份普通野生稻（O. rufipogon Griff.）进行了分析验证。PCR结果可以获得缺失和非缺失两种带型,缺失带型与以籼稻为母本的F2群体、10份籼稻材料完全对应;非缺失带型与以粳稻为母本的F2群体、11份粳稻材料完全对应,3份广西普通野生稻为非缺失带型,属粳型,1份以粳稻为母本的籼粳杂交材料为粳型。因此,cpDNA69可以用作叶绿体籼粳鉴定标记。利用该标记对22份杂草稻的叶绿体DNA鉴定的结果表明,7份早年发现的杂草稻,即江苏省连云港穭稻和安徽省怀远、来安、全椒、肥东的塘稻的叶绿体DNA为非缺失带型,属粳型,而近年来在江苏省扬中、高邮、灌云、洪泽、盐都、兴化、如皋等地直播稻田发现的15份红米杂草稻的叶绿体DNA为缺失带型,属籼型。这为进一步研究江淮流域杂草稻的来源提供了依据。     

广东雷州杂草稻黑壳基因Bh4和红皮基因Rc的基因型鉴定

为测定雷州杂草稻的黑色颖壳基因Bh4和红色果皮基因Rc的基因型,本研究对雷州10个杂草稻群体的100个单株的种子的颖壳和果皮颜色进行表型观察,同时通过PCR扩增及序列分析对Bh4和Rc的基因型进行鉴定。结果表明,雷州杂草稻中黑色颖壳和黄色颖壳的种子几乎各占一半,果皮颜色则以红色为主,有少量白色和浅红色果皮的种子。雷州杂草稻的Bh4和Rc的基因型与表型鉴定结果一致。57份黑色颖壳杂草稻的Bh4基因型为39个野生型和18个杂合型,25份黄色颖壳和18份黄色带黑斑颖壳杂草稻的Bh4基因型均为缺失22 bp的突变型;90份红色果皮杂草稻的Rc基因型为73个野生型和17个杂合型,4份白色和6份浅红色果皮杂草稻的Rc基因型均为缺失14 bp的突变型。本研究为分析雷州杂草稻的Bh4和Rc基因的来源提供了分子基础。     

河南小麦新品种（系）的多酚氧化酶基因等位变异

为了解河南小麦多酚氧化酶的基因型和表型分布情况,以72份河南小麦新品种(系)为材料,进行了籽粒多酚氧化酶活性测试,并利用多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因的功能标记PPO18、PPO16和PPO29分别进行2A和2D染色体上Ppo-A1和Ppo-D1的基因型鉴定。结果表明,参试品种(系)中,具有等位基因Ppo-A1a(与高PPO活性相关)和Ppo-A1b(与低PPO活性相关)的品种(系)分别为52个和20个,分布频率分别为72.2%和27.8%;具有等位基因Ppo-D1a(与低PPO活性相关)和Ppo-D1b(与高PPO活性相关)的品种(系)分别为51个和21个,分布频率分别为70.8%和29.2%。在参试小麦品种(系)中发现四种等位变异组合Ppo-A1a/Ppo-D1a、Ppo-A1a/Ppo-D1b、Ppo-A1b/Ppo-D1a和Ppo-A1b/Ppo-D1b,分布频率分别为50.0%、22.2%、20.8%和7.0%。进一步分析不同基因型组合对小麦籽粒PPO活性的影响,4种基因型中,Ppo-A1b/Ppo-D1a类型的小麦籽粒PPO活性最低。拥有低PPO活性的河南小麦新品种(系)相对较少,因此,建议在小麦品质育种中加强对低PPO活性材料的选择。     

四个丹东杂草稻的形态与微卫星标记分析研究

本研究采用19对籼粳特异性水稻微卫星标记,分析比较了4份丹东杂草稻（WS、WL、BS和BL）与标准籼粳对照品种之间的差异.同时应用程式指数法根据稃毛、酚反应、穗轴第1节间长度、抽穗时壳色、叶毛和谷粒长宽比等6项指标对杂草稻的籼粳属性进行分析.分子标记分析及形态特性分析结果表明,WL属粳型,另外三份杂草稻属于偏粳型.另外,发现丹东杂草稻和粳稻测验种的亲缘关系比东乡野生稻更近,表明杂草稻属于粳偏栽培型.由此推测丹东杂草稻可能是由古老栽培稻演变而来.试验结果对进一步了解研究杂草稻特性并在育种中利用其有利基因具有积极意义.     

粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因功能标记的开发与应用

 为提高粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因的选择效率,在前人克隆的基础上,根据其恢复系与不育系在Rf1a位点574 bp的碱基插入/缺失,设计出功能标记InDel Rf1a。利用该标记对不同地区来源的72份籼、粳稻材料进行检测,结果表明所有的常规籼稻品种、恢复系及保持系在Rf1a位点并不存在缺失,其基因型为Rf1aRf1a。这些材料对粳稻BT型细胞质雄性不育系具有恢复育性的作用;而绝大多数常规粳稻品种（爱知106和伊粳12号除外）在该位点存在缺失,其基因型为rf1arf1a,它们对BT型细胞质雄性不育系具有保持不育的能力。同时,为进一步验证该标记对不同基因型的检测效果,利用其对粳稻恢复系、不育系、杂交组合以及863A/宁恢 8号 F2分离群体的DNA进行扩增,根据其电泳带型可准确区分出Rf1a位点的3种基因型。     

基于HRM技术开发水稻糊化温度基因ALK功能标记

【目的】糊化温度是影响稻米蒸煮食味品质的重要指标,ALK是控制水稻糊化温度的主效基因,开发可快速高通量鉴定ALK基因型的功能标记有助于提高水稻品质改良的效率。【方法】根据ALK基因4198位、4329位和4330位存在的单碱基差异,设计基于HRM技术检测的基因功能标记。【结果】通过PCR检测结合测序分析,筛选了ALK基因2个功能区域的功能标记ALKH4、ALKH5。利用ALKH4、ALKH5对81份籼稻品种、279份粳稻品种进行了ALK基因型检测,结果发现,16份粳稻和19份籼稻为G-GC基因型;51份粳稻为A-GC基因型;212份粳稻和62份籼稻为G-TT基因型。【结论】基于HRM技术开发的基因功能标记ALKH4、ALKH5可以快速高通量鉴定控制糊化温度ALK不同基因型,具有重要的应用价值。     

一种水稻香味基因功能标记的开发

为了提高水稻香味基因的分子标记辅助选择的准确性,根据水稻隐性香型品种与非香型品种的BAD2基因（即香味基因）序列之间存在8 bp碱基缺失,设计出香味基因fgr的InDel功能标记GRFM04。利用该标记对粤丰B（香型）/振丰B（非香型）的F2分离群体和其他16份香稻品种和6份非香稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物电泳带型,可以准确地区分出香型纯合基因型、非香型纯合基因型和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的香味性状表现完全呈一一对应关系。     

小麦品种黄色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子标记检测

为了改良小麦加工品质、提高小麦育种效率,利用位于7AL和7BL染色体上与黄色素含量相关的八氢番茄红素合酶（Phytoene synthase,PSY）基因PsyA1的标记YP7A、YP7A2,基因PsyB1的标记YP7B1、YP7B2、YP7B3、YP7B4,以及位于2AL染色体上的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性基因PpoA1 的标记PPO18,对221份冬小麦品种（系）进行黄色素含量和多酚氧化酶活性基因的等位变异检测。结果表明: (1) 在所检测的小麦品种（系）中,含低黄色素含量等位基因PsyA1b的材料78份,频率为35.3%;含低黄色素含量等位基因PsyB1b 的材料117份,频率为52.9%;含高黄色素含量等位基因PsyB1c的材料31份,频率为14.0%;含PsyB1d等位基因的材料4份,频率为1.8%;未发现携带PsyB1e的材料。（2）含低PPO活性等位基因PpoA1b的材料119份,频率为53.8%。(3) 在221份材料中,黄色素含量和多酚氧化酶活性基因型皆符合中国面条和馒头加工品质要求的品种仅25份,聚合多个优良基因的小麦品质改良工作急需加强。本实验使用的标记均为基因特异性功能标记,重复性好,准确率高,可有效地应用于小麦品质改良的分子标记辅助选择。     

部分小麦品种(系)品质相关基因的分子检测

为了了解小麦品种(系)的遗传信息,提高优质小麦育种的效率,利用已有的品质相关基因的分子标记(Dx5、Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1、1BL/1RS、PPO18和PPO29)检测了144份黄淮麦区、3份国内其他麦区和8份德国品种(系)的基因等位变异类型。结果表明,5+10亚基类型、Wx-B1b和1BL/1RS易位的出现频率分别为34.8%、2.0%和47.1%,郑麦、新麦、淮麦、烟台以及徐麦等系列小麦品种(系)5+10亚基出现频率较高,而周麦系列中频率较低;未检测到Wx-A1b、Wx-D1b以及双缺失类型的材料;2A染色体上PPO等位基因Ppo-A1a(高PPO)、Ppo-A1b(低PPO)及杂合型基因型出现频率分别为45.8%、49.7%和4.5%,2D染色体上PPO等位基因Ppo-D1a(低PPO)和Ppo-D1b(高PPO)基因型出现频率分别为47.1%和52.9%,两个基因组合类型Ppo-A1b/Ppo-D1b(中等PPO)的出现频率最高,为29.0%,Ppo-A1a/Ppo-D1a(中等PPO)、Ppo-A1a/Ppo-D1b(双高PPO)以及Ppo-A1b/Ppo-D1a(双低PPO)的出现频率依次为23.9%、21.9%和20.6%;聚合多个优质基因的频率很低,同时含有5+10亚基、缺失1个Wx基因、非1BL/1RS易位以及双位点低PPO活性(Ppo-A1b/Ppo-D1a)的材料仅有1份(郑麦366),同时含5+10亚基、非1BL/1RS易位以及Ppo-A1b/Ppo-D1a的材料也仅占5.2%,应加大多个优异基因聚合品种的选育力度。     

抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特异性分子标记的开发

通过对已克隆的抗稻瘟病基因Pi2、Pi9以及Piz-t进行序列比对,寻找各自特异的核苷酸差异,成功开发了基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9/Piz-t以及Piz-t的基因特异性分子标记,能有效地将Pi2/Pi9/Piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开,这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供有效的分子标记。用Pi2/Pi9/Pizt基因特异性分子标记对来自全国各稻区的共101份水稻品种和育种亲本进行分子检测,结果发现,除2个品种检测到Piz-t带型之外,大部分水稻品种不携带这3个抗性基因,这为有目的地开展品种的抗性改良提供了重要的参考信息。     

茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析及原核表达

通过PCR方法扩增出迎霜品种茶多酚氧化酶（PPO）的编码区序列,并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。生物信息学分析表明,该基因编码区全长1800bp,编码599个氨基酸,分子式为C₃₀₀₈H₄₆₇₇N₈₁₃O₉₀₀S₁₈,存在两个铜离子结合域,没有跨膜区;进化树分析表明,茶与毛叶茶亲缘关系最近。成功构建了原核表达载体pET-ppo,并转化E. coli BL21（DE3）,实现了PPO的原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。     

多酚氧化酶活性基因等位变异在陕西小麦品种中的分布

为了解陕西小麦品种控制多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性的主效基因组成.利用PPO 18和PPO 29标记时138份推广品种的PPO-2A和PP(9-2D位点的等位变异进行了分子检测.结果表明,在PPO2A住点,含Ppo-A1a(高PPO活性)和Ppo-A1b(低PPO活性)等位变异类型的品种比例分别为47.1%和52.9%;在PPO2D位点含PpoD1a(中等低PPO活性)和PpcrD1b(中等高PPO活性)等位变异类型的品种频率分剐为30.4%和69.6%;含Ppo-A1a/Ppo-D1a(较高PPO活性)、PpoAla/PpoD1b(最高PPO活性)、Ppo-A1b/Ppo-D1a(最低PPO活性)、Ppo-A1b/Ppo-D1b(较低PPO活性)等住变异组合类型品种的频率依次为10.1%、37.0%,20.3%和32.6%;不同地区不同等位变异类型及其组合的分布比例也不同.总体来看,陕西低PPO活性的小麦品种比例偏低,选育低PPO活性品种应成为当前陕西小麦品质改良的主要目标之一.     

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率，有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异，利用Tetra-primer ARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm，对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F2分离群体进行基因型检测，并结合穗颈瘟人工接种鉴定，对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明，谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型，且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。     

稻瘟病广谱抗性基因Pigm特异性分子标记的开发和应用

【目的】来自籼稻品种谷梅4号的Pigm是一个对稻瘟病菌具有广谱和持久抗性的重要基因。为有效提高Pigm基因的选择效率,有必要开发具有特异性的共显性分子标记进行辅助育种。【方法】本研究根据谷梅4号Pigm位点存在的特异性核苷酸变异,利用Tetra-primer ARMS-PCR和KASP两种不同的基因分型技术开发出分子标记T-Pigm和K-Pigm,对不同品种(品系)以及淮稻9号/谷梅4号的F₂分离群体进行基因型检测,并结合穗颈瘟人工接种鉴定,对标记的准确性进行评价。【结果】序列比对分析表明,谷梅4号Pigm位点中Pigm-Nbs2基因起始密码子上游515 bp处存在一个特殊的单核苷酸变异。利用已开发的两种类型的分子标记能够有效区分3种不同的基因型,且基因型与穗颈瘟人工接种鉴定结果完全一致。【结论】利用分子标记T-Pigm和K-Pigm可以实现对Pigm基因型快速、准确的检测,加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进程。     

利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,编辑原花青素转录调节因子Rc基因,恢复红种皮特性,以改良水稻米质,提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以Rc为靶基因,构建突变载体p YLCRISPR/Cas9-Rc-g RNA,以空育180、上育453为材料,转化获得转基因植株,通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种,其中KY-1在1414―1417bp缺失4个碱基,终止子突变为苯丙氨酸;SY-1在1411bp处缺失1个碱基,终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型,且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系,为红米改良提供基础材料。     

Development of new markers to genotype the functional SNPs of SSIIa, a gene responsible for gelatinization temperature of rice starch

Gelatinization temperature (GT) is an important quality predictor that determines the cooking quality of rice. GT is genetically controlled by the starch synthase IIa (SSIIa) gene. Two functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) inside the SSIIa have already been found to be responsible for the variation of GT. One of these, GC/TT SNP at 4329/4330 bp, could be genotyped by four primers in a single PCR ( Bao et al., 2006a), but another one, G/A SNP at 4198 bp, has not been detected by a PCR-based marker. Here, we developed cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and derived cleaved amplified polymorphic sequence (dCAPS) markers to detect these SNPs. A dCAPS marker that the PCR products were cleaved by the BseR I restriction endonuclease was designed to detect GC/TT SNP. Both CAPS and dCAPS markers were designed to detect G/A SNP using the restriction endonuclease Nla III and Tsp45 I, respectively. All the markers developed were co-dominant. It was known that the A allele of G/A SNP was rare among rice germplasm, but it was still in use by rice breeders. 11 rice accessions including landrace and breeding lines with A allele of G/A SNP were detected. The F₂ individuals from two crosses were used to analyze the co-segregation between the SNP alleles and the GT. The segregation ratio of two SNPs did not conform to the expected Mendelian ratio of 1:2:1, but the SNPs were co-segregated with GT. The markers developed in the present study would be useful in molecular breeding for the improvement of the quality of rice grain.     

Mapping a Rice Glabrous Gene Using Simple Sequence Repeat Markers

Inheritance analysis and gene mapping of the glabrous trait were conducted using the crosses between a pubescent rice material Chuanxiang 29B (an aromatic elite maintainer line of hybrid rice), and two glabrous rice materials, Lemont and R2 (R2 is a new restorer line of hybrid rice). All F1 plants from the two crosses had pubescent leaves, confirming that the pubescence trait in Chuanxiang 29B is dominant over the glabrous trait. In F2 individuals, the segregation ratio of three pubescent to one glabrous plant suggests that a single glabrous gene was present in Lemont and R2. Using the bulked segregant analysis, the linkage analysis of the simple sequence repeat markers showed that the glabrous gene, gl-1, was flanked by GL311 and GL8 with the genetic distances of 0.19 and 0.92 cM on chromosome 5, respectively.     

水稻根系中磷高效吸收和利用相关基因表达对低磷胁迫的应答

研究水稻耐低磷机制,对高效利用土壤磷的水稻品种改良具有重要意义。应用基因芯片和qRT-PCR技术,分析了耐低磷水稻品种仪2434和低磷敏感品种通粳981根系中磷高效吸收和利用相关基因表达对低磷胁迫的应答。水稻叶片磷含量的测定结果表明,低磷胁迫下仪2434的叶片磷含量较对照降幅小,这表明仪2434较通粳981具有更强的磷素吸收利用能力。基因芯片检测结果表明,在低磷胁迫下的仪2434根系中,PHR1、osa-miR399s和SPXs基因的表达诱导、激活磷饥饿信号途径;APA、PAPs、MPE、PA、PEPC和VDAC1、C4-DT/MAT等基因的表达诱导,增强有机磷水解酶和有机酸的合成和分泌,促进介质中难溶性磷的活化;OsPT2、OsPT6基因的表达诱导,促进仪2434根系对磷的高效吸收。qRTPCR检测结果表明,仪2434根系中与磷饥饿信号转导、磷活化、磷高效吸收相关的8个代表性基因(PHR1、SPX、PAP、APA、PEPC、MFS、OsPT2、OsPT6)的表达水平均随低磷处理时间的延长呈逐步增高的趋势;经低磷处理后,所检测的8个基因在仪2434根系中的转录水平均显著高于其在通粳981根系中的转录水平,PHR1、APA、OsPT2在通粳981根系中的表达诱导作用不明显,且仪2434根系组织和根系分泌的酸性磷酸酶活性较通粳981增强更显著,这可能是仪2434较通粳981对低磷胁迫有较高耐性的主要机制之一。     

Identification and Genetic Mapping of a Lesion Mimic Mutant in Rice

A lesion mimic stripe mutant,designated as lms1(lesion mimic stripe 1),was obtained from the M2 progeny of a 60Co γ-radiation treated japonica rice variety Jiahua 1.The lms1 mutant displayed propagation type lesions across the whole growth and developmental stages.Physiology and histochemistry analysis showed that the mutant exhibited a phenotype of white stripe when grown under high temperature(30 ℃),and the lesion mimic caused by programmed cell death under low temperature(20 ℃).The genetic analysis indicated that this lesion-mimic phenotype is controlled by a single locus recessive nuclear gene.Furthermore,by using simple sequence repeat markers and an F2 segregating population derived from two crosses of lms1 × 93-11 and lms1 × Pei'ai 64S,the lms1 gene was mapped between markers Indel1 and MM0112-4 with a physical distance of 400 kb on chromosome 6 in rice.