李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

侵染百合的李属坏死环斑病毒病（PNRSV）的研究

 【目的】在分子水平上鉴定百合上发生的李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）【方法】对待测百合种球随机抽样，在温室内种植并观察，长出叶片后，用RNA Extraction Kit (Sangon, China)从幼嫩的叶组织中提取核酸，将反转录出的cDNA用 PNRSV的特异性引物进行PCR扩增，电泳PCR产物得到了450bp的目的片段。低熔点胶回收并克隆至pGEM-T-easy载体测序后进行序列比对分析。【结果】 从百合中所扩增的450bpcDNA的核苷酸序列与27个早期已报道的PNRSV分离物的CP 基因的同源性为84.5%～99.1%。【结论】百合是PNRSV的一新寄主。     

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^PNRSV,转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64 000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。     

7种番木瓜环斑病毒分离株外壳蛋白基因的克隆与序列比较

采用RT-PCR技术对我国海南、云南、广西和广东等不同番木瓜生产区的7个番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV-CP)进行克隆和鉴定分析。PRSV-CP编码区在864～873核苷酸之间,编码288～291氨基酸。对分离的7个PRSV-CP的核苷酸及氨基酸序列的比较结果表明大部分序列差异都处于N端,而各产区番木瓜PRSV-CP基因的3′端586～864bp区段,即278bpDNA片断的同源率最高,达到98.5%。这一同源序列的获得为利用植物基因工程培育广谱抗病性的番木瓜新品系奠定了基础。     

樱桃李属坏死环斑病毒病发生调查监测研究

通过田间调查监测,在经过多年实践研究的基础上,提出了李属坏死环斑病毒病田间调查监测方法,研究总结出该病的发生动态、其发生程度与地势、管理、品种、树龄等的关系,可供李属坏死环斑病毒病科学控制研究等参考。     

樱桃李属坏死环斑病毒病综合控制技术研究初报

通过药剂试验,筛选出防治樱桃李属坏死环斑病毒病较好的药剂和药剂使用方法,20%盐酸吗啉双{胍*胶}铜可湿性粉剂、3.85%三氯唑核苷*铜*锌水乳剂、含氨基酸叶面肥巨创、18%丙多*吗啉胍可湿性粉剂对樱桃李属坏死环斑病毒病有一定的防治作用,喷雾处理20%盐酸吗啉双胍*胶铜可湿性粉剂、3.85%三氯唑核苷*铜*锌水乳剂、含氨基酸叶面肥巨创、18%丙多*吗啉胍可湿性粉剂平均防效分别是56.42%、{54.15%}、52.11%、52.62%.1 a内随着防治次数的增加,防治效果也随着增加,结合该病发生规律,提出樱桃李属坏死环斑病毒病综合控制措施.     

樱桃李属坏死环斑病毒病病情分级方法研究

通过实验室鉴定、田间定点调查监测,在经过多年实践研究的基础上,根据樱桃李属坏死环斑病毒病的症状表现和发生规律等,提出了以叶片穿孔程度作为分级标准的病情评价指标,可供李属坏死环斑病毒病发生规律研究及其防治效果评价等参考。     

西安地区樱桃李属坏死环斑病毒病鉴定和田间发生规律

通过实验室鉴定、田间定点监测和大田调查,发现樱桃李属坏死环斑病毒病可通过嫁接、汁液摩擦等途径传播,病毒形态为球形,大小30 nm,无包膜;在西安地区年发生消长历经始发期、快速增长期、稳定期、衰退期4个阶段,一年具有两个发病高峰,相邻年份病害发生差异不大,但有一个缓慢增长的过程.川道、密度大、管理粗放有利于樱桃李属坏死环斑病毒病的发生,目前种植的大樱桃品种发病较重,当地小樱桃品种发病较轻.     

浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒

采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),对杭州、嘉兴、绍兴3市6县(市、区)的果树园林植物进行李属坏死环斑病毒病的病情调查,采集检测样品包括樱桃、桃、李、杏和月季等12种寄主植物共计102个.结果表明,10个海宁月季样品的ELISA结果呈阳性,其他样品呈阴性;阳性样品经RT-PCR检测和CP基因测序验证,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒.     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

水稻条纹病毒安徽分离物CP基因的克隆及序列分析

采集安徽庐江水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA.设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒安徽分离物(RSV-AH)的RNA3部分片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1051个核苷酸,其中包含的CP基因全长969个核苷酸,编码322个氨基酸.将RSV安徽分离物CP基因(AH-CP)与其它来源的RSV CP基因进行核甘酸序列相似性比较,结果表明,安徽庐江的RSV CP基因与江苏洪泽的RSV CP基因序列相似性最高,达99.3%.进一步构建RSV CP基因系统关系树,发现安徽庐江的RSV CP基因同样与江苏洪泽的RSV CP基因亲缘关系最近.     

陕北地区马铃薯X病毒CP基因的RT-PCR检测及其序列分析

【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县（区）种植2～3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为620 bp目的片段,可知这些马铃薯均感染了X病毒。不同CP基因序列之间存在微小变异,8个县(区)样品间CP基因的序列一致性在95.2%～99.4%,与国内外其他地区12个样品CP基因的序列一致性在92.9%～98.5%。系统进化树显示,将X病毒可分为4个类群,而陕北8县(区) 马铃薯X病毒归属于其中的2个类群。【结论】马铃薯X病毒在陕北地区普遍存在,RT-PCR方法可快速、准确地检测到马铃薯X病毒,X病毒CP基因存在一定程度的变异。     

草莓镶脉病毒(SVBV)CP基因的克隆及序列分析

用CTAB法从感染草莓镶脉病毒(SVBV)的草莓叶片中提取总DNA,设计3对特异性引物扩增SVBV CP基因的3个片段,分别克隆并测序.经序列拼接得到SVBV CP基因完整序列,全长1407 nts,编码468个aa.将它与美国报道的SVBV(NC001725)以及花椰菜花叶病毒属其它成员的CP基因相比较,结果表明,SVBV CP基因与SVBV(NC001725)CP基因序列相似性最高,达83.4%;而与花椰菜花叶病毒属其它成员的CP基因序列相似性均较低,仅为27.1%～33.2%.构建SVBV及其同属其它成员CP基因的系统关系树,结果显示中国SVBV与SVBV(NC001725)单独形成一个分支,而与其同属其它成员的亲缘关系均较远.     

梅花PmCBFa基因的克隆与序列分析

为了找到梅花抗寒关键基因,进一步了解梅花的抗寒分子机理,在分析了NCBI核苷酸数据库中已公布的CBF/DREB1同源基因序列基础上,通过基因同源克隆结合RACE技术,在‘雪梅’花蕾cDNA文库以及‘雪梅’gDNA中均成功扩增得到梅花的1个CBF/DREB1类基因,命名为PmCBFa。该基因CDS区全长845bp,编码231个氨基酸。经核苷酸序列分析、预测编码氨基酸序列比对分析以及编码蛋白系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白具有CBF/DREB1类转录因子保守的AP2结构域及其两翼结构序列,且与桃的DREB1同源蛋白同源性最高。该研究结果为后续PmCBFa基因在梅花抗寒分子机理的研究中提供了理论依据,为梅花抗寒育种开辟了新的途径。     

番木瓜环斑病毒海南分离物全基因组结构分析

从感病的海南番木瓜叶片中提取总RNA,经RT-PCR和RACE方法分段扩增番木瓜环斑病毒(PRSV)全基因组序列.序列拼接结果显示,PRSV中国海南分离株(HaiNan-P)基因组除3'-末端polyA尾巴外,由10323个核苷酸组成,编码3343个氨基酸.同源性分析表明,HaiNan-P编码的氨基酸序列与GenBank中公布的11株PRSV同源性为89.8%～93.2%,略高于全长核苷酸的82.3%～89.1%.P1蛋白编码区同源性较低,仅为65.4%～80.1%,而HC-Pro、CI及CP同源性相对较高.运用MEGA 3.1软件、NJ法绘制系统进化树,分析结果显示,PRSV分离株类群分化与地理分布有一定的相关性.     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测

调查表明云南省昆明市团结乡香石竹普遍发生病毒病。电镜负染检测采自团结乡香石竹病毒病病样,病叶汁液中观察到弯曲长线型的病毒粒体,长度约1000~1600 nm,直径约12 nm。对这些病样的叶片进行间接ELISA检测,所有样品与香石竹坏死斑点病毒抗血清都呈阳性反应。按照报道的长线形病毒属简并引物合成引物,采用RT-PCR法对血清反应呈阳性的香石竹总RNA扩增了1059ntsHSP70基因部分编码序列,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行序列分析。根据测序结果设计引物建立RT-PCR扩增检测方法并测定其灵敏度。结果表明,使用简并引物和新设计的引物均能从CNFV感病香石竹组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。灵敏性测定结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释106植物总RNA中检测出病毒。     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.