正交设计优化烟草SSR反应体系

以烤烟品种K326为材料,探讨影响烟草SSR扩增的各种因素,建立能够稳定扩增烟草基因组的体系,为研究烟草重要性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.结果表明:在总体积为20 μl的PCR反应中,含35 ng模板DNA,1.5U聚合酶.MgCl2终浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为200 μmolVL,引物浓度为0.05 μmol/L时效果较好.     

黄瓜SSR-PCR反应体系的优化

采用L9(34)正交试验设计,研究了黄瓜SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并比较了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,最适反应体系为:在20μL体系中包括dNTP 200μmol.L-1、Primer 0.4μmol.L-1、Mg2+2.5μmol.L-1、Taq酶0.5μmol和模板DNA60 ng。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物结果更准确。     

利用正交设计优化白桦的SSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对白桦SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2 ,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SSR-PCR反应的最佳体系(20μL):DNA100ng,Mg2 浓度为3mmol·L-1,Taq酶0.5U,dNTP浓度为0.5mmol·L-1,引物浓度为0.4μmol·L-1。对白桦SSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火温度,得到的最佳退火温度为59.9℃。     

水稻SSR-PCR技术反应体系的优化

以水稻为材料,研究了SSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA浓度时水稻SSR扩增效果的影响.结果表明,在试验设计范围内,Mg2+和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在1.6～3.0μmol·L-1范围内对扩增影响较小,TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对扩增影响也很小.确定的最佳反应体系为20μL,Mg2+浓度为1.75 mmol·L-1、dNTPs为0.20 mmol·L-1、引物为2.4 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶为0.75U、模扳DNA为45ng.     

正交设计优化稻瘟病菌SSR-PCR反应体系

[目的]筛选最佳的稻瘟菌SSR—PCR反应体系。[方法]利用正交设计对稻瘟菌SSR—PCR反应体系中的5个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平并进行退火温度梯度试验筛选最佳的退火温度。[结果]稻瘟菌SSR-PCR反应的最佳体系为：反应总体积为20μl,raqDNA聚合酶1．0U,Mg^2＋ 2．0mmol／L,DNA100ng,dNTP50la,mol／L,引物（ms355～356）0．4μmol/L,最佳退火温度为58．5℃。在此体系下可从稻瘟菌材料基因组DNA中扩增出300bp左右清晰的目的条带,说明该体系稳定,适用于稻瘟菌基因组DNA的SSR标记。[结论]该研究为稻瘟菌的分子标记、遗传多样性研究和分子育种奠定了基础。     

番茄SSR-PCR反应体系的优化

为了确定番茄的SSR-PCR的最佳反应体系,采用2×Taq PCR Master Mix,对Taq酶、Mg2+、dNTPs进行综合考虑,探究其对番茄SSR-PCR反应体系的影响,并优化出最佳的反应体系。结果表明:引物用量对结果影响最大,其次是DNA用量,Master Mix用量对结果影响最小。最佳反应体系为:模板(50ng·μL-1)DNA2μL,Master Mix 9μL,引物3μL。     

利用正交设计优化黄瓜的SSR-PCR反应体系

以白皮黄瓜B-2-2为试材,采用正交设计L16(45)在4个水平上对影响黄瓜SSR-PCR反应体系的Taq酶浓度、Mg2 含量、模板DNA用量、dNTP浓度及引物用量等5个因素进行了试验优化,并用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平,建立了黄瓜SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:在20μL反应体系中,Taq酶最适浓度为0.5U,Mg2 最适浓度为2.0 mmol/L,模板DNA最适用量为5 ng/μL,dNTP最适用量为0.2 mmol/L,引物最适浓度为0.6μmol/L;引物最佳退火温度为50.0℃。利用20个黄瓜材料验证此反应体系,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100~300 bp之间多态性高,且反应体系的稳定性和重复性好。     

正交设计优化茄子SSR反应体系

以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。     

国槐SSR-PCR反应体系的建立与优化

利用单因素试验结合L₁₆（4⁵）正交试验设计对国槐SSR-PCR反应体系中的5个主要影响因素(Mg²⁺、引物、dNTPs、ExTaq酶、模板DNA用量)进行优化,确定最佳反应体系为（10μL）:25 mmol/L Mg²⁺1.0μL,2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL,10μmol/L上下游引物共0.5μL,5 U/μL ExTaq酶0.05μL,30 ng/μL模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,ddH₂O 6.25μL。随机挑选4对SSR引物和8个国槐种质对试验确定的最佳反应体系进行验证,均能获得清晰、稳定的条带。该优化反应体系的建立为利用SSR标记对国槐种质资源进行深入研究和利用奠定了基础。     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化

以番茄(Lycopersicon esculentum)基因组DNA为模板,对番茄ISSR-PCR反应体系的Mg2 、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度进行了探讨,确立了适合番茄植物ISSR分析技术体系,为番茄植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

梨SRAP体系的正交优化研究

SRAP是一种基于PCR的新型分子标记,本试验利用正交试验设计对梨SRAP—PCR反应体系中的Mg^2＋、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物5个组分浓度进行优化。确定优化的反应体系为：Mg^2＋浓度2．4mmol／L,dNTPs 200μmol／L,Taq DNA聚合酶1U,模板DNA 80ng,引物浓度0．2μmol／L,反应总体积25μl,同时对该优化体系的稳定性及在梨种间的多态性进行了检测。     

麂角杜鹃ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取麂角杜鹃基因组DNA,利用单因素试验测试模板DNA、Mg^2＋、dNTP、BSA、引物、Taq酶等条件因子对麂角杜鹃ISSR—PCR扩增结果的影响。试验表明,麂角杜鹃ISSR分析的最适PCR反应条件为,10μl PCR反应体积中含：1×Taq酶配套缓冲液（10mmol／L Tris·HCl,pH值9．0,50mmol／L KCl,0．1％ Triton X-100）,5ng模板DNA,1．0mmoL／L MgCl2,0．4mmol／L 4×dNTP,1mg／ml BSA,5pmol引物,0．25U Taq酶。利用所建立的优化反应体系对浙江省大明山4个麂角杜鹃种群共84个个体进行遗传多样性分析,结果显示其总的多态位点百分率为88．07％,Nei指数为0．3099,Shannon信息指数为0．4640,表明麂角杜鹃种群遗传多样性处于较高水平。     

甜槠ISSR-PCR反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei进行遗传多样性研究的过程中,为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR扩增结果,利用正交设计对Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶,牛血清蛋白(BSA)和模板DNA等6种因素5个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR最适宜反应体系为:10μL反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH 9.0,50 mmol.L-1KCl,10 g.L-1TritonX-100),1.7 mmol.L-1Mg2 ,0.25 mmol.L-1dNTP,8.34 nkatTaqDNA聚合酶,1.5 g.L-1牛血清白蛋白,6 pmol引物,12 ng模板DNA。甜槠扩增时引物UBC846的最适退火温度为56.3℃。图2表1参23     

甜槠ISSR-PCR 反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei 进行遗传多样性研究的过程中, 为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR 扩增结果, 利用正交设计对Mg 2+ , dNTP , 引物, Taq 酶, 牛血清蛋白(BSA )和模板DNA 等6 种因素5 个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR 最适宜反应体系为:10 L 反应体中, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 10 gL-1 TritonX-100), 1.7 mmolL-1 Mg 2+ , 0.25 mmolL-1 dNTP , 8.34 nkat Taq DNA 聚合酶, 1.5 gL-1牛血清白蛋白, 6 pmol 引物, 12 ng 模板DNA 。甜槠扩增时引物UBC846 的最适退火温度为56.3 ℃。图2 表1 参23     

孑遗植物水松基因组DNA提取及ISSR反应体系建立

以不同种源水松叶片为材料,应用改良CTAB法提取水松基因组DNA,并对ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明:利用改良CTAB法提取的水松基因组DNA产量高、质量好,符合ISSR分析要求.通过正交试验设计,探讨不同浓度DNA模板、引物、dNPT、Taq DNA聚合酶对水松ISSR-PCR反应体系的影响.     

正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

对影响PCR反应的主要因子-Md2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系.RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L.ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25 μmol/L.     

利用正交设计法优化观赏贝母ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对观赏贝母ISSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、引物、Mg<'2+>、dNTP、TaqDNA聚合酶的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用Mnitab数据处理软件分析,建立的最佳反应体系(20 μL)为:模板DNA 10 ng、引物0.5μmoL/L、Mg<'2+> 2.5 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U.对观赏贝母IS-SR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验,得到的最佳退火温度为57.9℃.     

正交设计优化花菜类SRAP分子标记体系的研究

采用正交设计,从Mg^2＋、dNTPs、引物三种因素3个水平对青花菜SRAP反应体系进行优化,确立适合青花菜的SRAP反应体系,并在6个青花菜和花椰菜品种中进行验证。结果表明：20μ/L反应体系中适宜体系的浓度dNTPs为0．2mmol／L、Mg^2＋为1．25mmol／L、上下引物各0．4μmol／L、DNA为20ng、Taq酶1．2U、退火温度为50℃。