2株昆虫病原线虫共生菌发酵物杀虫活性研究

【目的】研究嗜线虫致病杆菌X.nematophilaYL001(YL001菌株)和伯氏致病杆菌X.bovieniiYL002(YL002菌株)发酵物的杀虫活性,为昆虫病原线虫共生菌生物农药的开发和抗虫基因工程研究提供理论依据。【方法】采用注射法、浸液法及小叶碟添加法,分别测定了YL001和YL002菌株发酵无菌滤液,对大蜡螟、粘虫、小菜蛾及棉铃虫的血腔毒性及毒杀、生长抑制和拒食活性,并对其特性进行了初步检测。【结果】YL001和YL002菌株无菌滤液对大蜡螟和粘虫5龄幼虫均具有较高的血腔毒性,用其不同培养时间的无菌滤液处理大蜡螟和粘虫,48 h后大蜡螟的死亡率均为100%,粘虫的死亡率随共生菌培养时间的延长而逐渐降低。YL001和YL002菌株的无菌滤液对小菜蛾3龄幼虫和棉铃虫初孵幼虫的毒杀活性和生长抑制活性均较低,对5龄棉铃虫幼虫的拒食活性也很低,48 h的平均拒食率分别为24.0%和29.0%。2菌株无菌滤液经50℃处理后,对大蜡螟5龄幼虫的血腔毒性无影响;经70℃处理后毒力明显降低。2菌株无菌滤液对蛋白酶较敏感。【结论】YL001和YL002菌株对害虫有较高的血腔毒性,但毒杀、生长抑制及拒食活性较低,其血腔毒素可能主要是蛋白类物质。     

昆虫病原线虫共生细菌的分子鉴定及其培养特性的初步研究

【目的】确定昆虫病原线虫共生细菌YL001和YL002菌株的分类及其系统进化地位,并为该类生物资源的后续研究及开发应用奠定基础。【方法】对YL001和YL002菌株进行分子鉴定,PCR扩增并克隆其16SrRNA全序列,对其全序列进行了序列测定及系统进化分析,并采用参数测定法对其培养特性进行了初步研究。【结果】YL001和YL002菌株与嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)种内菌株形成一个类群,序列同源性大于99%,与发光杆菌(Photorhabdus)属内菌株的序列同源性大于94%。2菌株的延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期分别为0~6,6~18,18~66和66 h;培养12 h后,YL001和YL002菌株发酵液的pH值分别降低至5.70和5.56,此后逐渐上升,至发酵结束时其pH值分别为7.74和8.07;培养0~18 h时2菌株发酵液中还原糖含量迅速降低,此后保持稳定;12 h时氨基氮含量达到最低,此后开始缓慢上升;YL001菌株培养54 h后及YL002菌株培养42和66 h后,其对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用最强。【结论】YL001和YL002菌株属于嗜线虫致病杆菌种内的菌株;YL001和YL002菌株的培养特性符合细菌生长和代谢的一般规律,其适宜的发酵周期分别为54和66 h。     

2株昆虫病原线虫共生菌代谢产物的抑菌作用

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila YL001(简称YL001)和伯氏致病杆菌Xenorhabdusbovienii YL002(简称YL002)是分别从陕西杨凌土壤中筛选的2株昆虫病原线虫体内分离鉴定获得的共生菌。对这2株昆虫病原线虫共生菌发酵液及其无菌滤液的抑菌作用进行了研究。室内活性测定结果表明,2菌株对供试的14种植物病原真菌和5种病原细菌均有不同程度的抑制作用。其中,YL001发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、辣椒疫霉菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌和稻瘟菌,YL002发酵液对辣椒疫霉菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌和小麦纹枯菌的抑制率均在75%-100%;无菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,EC50分别为16.65和15.19 mL/L;YL001和YL002发酵液及其无菌滤液均对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用较弱。盆栽试验结果表明,辣椒种子用YL001和YL002发酵液处理后,对辣椒疫霉病的防治效果分别为60.6%和73.2%;100 mL/L发酵液处理土壤后,对辣椒疫霉病的防治效果分别为48.72%和74.34%。     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

昆虫病原线虫共生菌筛选及其发酵液抑菌活性初步研究

对分别采自陕西杨凌、汉中、渭南、太白4地区的315份土样进行了昆虫病原线虫筛选及其共生菌分离,得到2种昆虫病原线虫及1株Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌。Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌经初步鉴定为致病杆菌属(X enorhabdus)的嗜线虫致病杆菌种(X enorhabdus nem a toph ilus)内的一个变种;对其抑菌活性研究结果表明,Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长具有不同程度的抑制作用,其中对小麦纹枯病菌与辣椒疫霉病菌有强烈的抑制作用,对番茄灰霉病菌孢子萌发有延缓作用。     

不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制作用

为了探明不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制效果,本研究测定了2株伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovieniiHJ4)和(X.bovienii HF22)及2株发光杆菌(Photorhabdus luminescens F30-4)和(Pho-torhabdus sp.S21)对灰霉(Botrytis cinerea)的抑菌活性。结果表明:4个菌株的培养液对灰霉病菌均有一定的抑制作用,稀释5倍的培养液对菌丝生长抑制率达70%~85%,稀释10倍的培养液抑菌效果仍达50%以上。其中HF22菌株效果最好,其稀释5倍的培养液抑菌效果可达84.92%;另外,滤液对灰霉病菌的孢子萌发也有一定的抑制作用,其中HJ4菌株效果最好,稀释5倍时达34.98%。HF22菌株的细胞10倍稀释液、滤液10倍稀释液的抑菌率分别为74.19%和18.92%,可见其抑菌物质主要存在于细胞中。用不同温度对HF22菌株的细胞、滤液进行处理,结果表明温度对其滤液抑菌活性无影响,而其细胞能耐50℃处理10 min,但在70℃处理10 min时,其抑菌活性显著下降;HF22菌株的滤液经20 W紫外灯照射0.51、h时,对其抑菌活性无显著影响,而细胞经紫外线照射0.5 h时其抑菌活性则显著降低。     

昆虫病原线虫Oscheius myriophila 共生细菌菌株B1 的分离与鉴定

从昆虫病原线虫(Oscheius myriophila)华农种群HN体内分离得到1株共生细菌B1。该菌株在NA培养基上形成的菌落为圆形,白色,表面光滑,不透明,隆起,边缘整齐;革兰氏阴性,短杆状,单鞭毛,有荧光。Biolog检测结果显示B1为沙雷氏菌(Serratia sp.);用引物27F/1492R进行PCR扩增,得到B1的16S rDNA扩增产物大小为1 445 bp。Blast搜寻和比对结果表明,该菌株16S rDNA序列与所选的17个嗜线虫沙雷氏菌(S.nematodiphila)的相似度达97%~100%,并以高置信度(99)与这17个嗜线虫沙雷氏菌种群及4个粘质沙雷氏菌(S.marcescens)种群聚于1个单支系中。综合形态和16S r DNA序列特征以及Biolog检测结果,将共生细菌B1鉴定为嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)。     

昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因的克隆与序列分析

为了准确克隆昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因,根据已报道的菌毛蛋白亚基序列设计引物,以昆虫病原线虫共生菌YL001的总DNA为模板进行PCR扩增,获得1条大约500 bp的特异性片断,将此片断克隆到T-easy载体上,获得了重组子pGEM-PSYL001,序列测定和结构分析结果表明,PSYL001阅读框全长537bp,编码179个氨基酸,预测分子量和等电点分别为18.9 ku和6.94,GenBank登录号为DQ537944。与GenBank(AY140909)上公布的Xenorhabdus nematophilus菌毛蛋白亚基核苷酸序列的同源性为99%,氨基酸序列的同源性为98%。上述分析表明,菌毛蛋白亚基基因得到了成功克隆。     

一株苦参内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究

从药用植物苦参的新鲜种子中分离纯化出内生真菌BS002菌株,并通过形态学观察和16S rDNA分子生物学鉴定确定其种属;同时研究了该菌株对24种常见农业致病真菌及16种农业致病细菌的抑制作用。结果表明:内生真菌BS002的菌落中间呈深绿色,菌落边缘呈白色,菌丝体粗大,相互交织,呈放射状,颜色透明,菌丝有膈,成熟的菌株长出子实体,分生孢子头生在扫帚状分枝上,具有真菌气生菌丝体的特征结构;经分子生物学鉴定,BS002菌株的ITS序列与Penicillium sp.M-01的相似性为100%,是青霉属的一个变种;内生真菌BS002对梨轮纹病菌(Physalospora piricola)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengriana f.sp.piricola)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum Ell.et Arthur)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporoum f.sp.cucumerinum)等具有较好的抑制作用;其对梨轮纹病菌的抗菌作用最好,抑菌直径可达45 mm。     

恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌活性及抑菌物质合成相关基因表达的影响

为明确恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌物质产生及相关抑菌物质合成的影响,对pH 5.5、pH 7.0及pH 8.5培养条件下X.nematophila YL001的抑菌活性、主要抑菌物质[Xenocoumacin1(XCN1)和Nematophin]的代谢差异及主要抑菌物质的生物合成基因与相关转录调节子基因的表达量进行分析。结果表明,X.nematophila YL001发酵液对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 7.0时最佳,而其胞外产物乙酸乙酯与甲醇提取物对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 8.5时最佳;LC-MS分析表明,随pH的升高,活性物质xcn1的相对含量逐渐升高,而Nematophin的相对含量则先升高后下降;qRT-PCR分析表明,不同恒定pH下,X.nematophila YL001主要抑菌物质生物合成基因及相关转录调节子基因的表达量存在显著差异。pH可显著影响X.nematophila YL001菌株的抑菌活性及代谢,且碱性条件更利于活性物质的产生并保持稳定性。     

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

 嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生，对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫，中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ 6 h后中肠组织开始发生变化：首先围食膜前端破碎，中肠柱状细胞伸长；随着时间推移，12 h后整个围食膜被破坏消失，中肠组织病变加重，肠壁细胞排列疏松混乱；随着毒素作用的逐渐减弱，处理72 h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜，同样可以导致围食膜破碎。     

伯氏致病杆菌(Xenor habdus bovienii BE)杀虫活性物质的分离和生物测定

对斯氏线虫(Steinernera feltiae)比利时品系的共生菌伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii BE)进行发酵培养,测定结果显示,该菌发酵液对供试昆虫大蜡螟老龄幼虫有很高的血腔毒性.对发酵液硫酸铵盐析和乙酸乙酯抽提物等衍生物进行测定,发现共生菌的杀虫物质主要为胞外和胞内蛋白成分,且胞内粗提蛋白活性明显高于胞外蛋白.对两种粗提蛋白进行Marker分子量范围为(1.43～9.72)×104 的SDS-PAGE分析,发现胞外粗提蛋白在此分子量范围内没有明显的条带,而胞内粗提蛋白则有较明显的5个条带.研究表明胞内粗提蛋白具有较高的热稳定性,测定的盐析最佳硫酸铵饱和度为80%,此粗提蛋白在24 h和48 h后对昆虫血腔毒性的LD50值分别为4.731 6 g/L和 1.571 5 g/L;其在5 d后对二龄幼虫的口服LD50为 253.757 9 μg/g.胞内粗提蛋白凝胶过滤后呈现4个峰值,分别对其进行SDS-PAGE分析,只有浓度较大的峰值1和4产生明显条带,分子量分别为6.64×104 和(2.01～2.90)×104 的2种复合蛋白;分别对它们进行血腔和口服毒性生物活性测定,发现分子量为(2.01～2.90)×104的2种复合蛋白杀虫活性高于分子量为6.64×104 蛋白的杀虫活性,其在24 h和48 h后对昆虫血腔毒性的LD50分别为 0.377 2 g/L和 0.123 8 g/L,其在5 d后对二龄幼虫的口服LD50为 93.002 1 μg/g.     

昆虫病原线虫共生菌对玉米弯孢菌的抑菌活性及其抗逆性

利用从国内采集土样中收集到的23个品系昆虫病原线虫和5个本室保存的线虫品系分离共生菌,通过对共生菌菌株发酵液和初提物抑菌活性的测定,得到1株对玉米弯孢菌具有良好抑菌活性的共生菌菌株SY5,抑菌圈平均直径分别为50.00mm和33.34mm,并对抑菌活性强的菌株发酵液的抗逆性进行了初步探索,结果表明,共生菌菌株SY5在50℃下处理60 min和100℃高温下10 min,其抑菌活性依旧很高;18W紫外线照射120 min对共生菌SY5的抑菌活性的影响不明显;常温保存150d,抑菌活性下降。     

共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化

【目的】了解人工饲养的兰州熊蜂（Bombus lantschouensis）肠道内共生菌群的组成,探明主要肠道共生菌群在熊蜂生长发育过程中的变化规律,为进一步开展熊蜂共生菌功能的研究奠定基础。【方法】以兰州熊蜂肠道总DNA为模板,使用细菌通用的774F和1391R引物进行PCR扩增,构建细菌16S rDNA文库,挑取单克隆菌落测序,测得序列去除chimera后,以序列相似性97%为标准,划分分类操作单元（operational taxonomic units,OTU）,采用BLASTn进行序列同源性分析,确定细菌种类,分析熊蜂肠道菌群的组成。根据克隆文库测得的Gilliamella apicola和Snodgrassella alvi细菌16S rDNA序列设计特异性引物。用G. apicola和S. alvi的特异性引物进行PCR扩增,构建重组子质粒,构建好的质粒经浓度测定后,10倍梯度稀释成5个浓度梯度,进行荧光定量PCR检测,绘制标准曲线。以兰州熊蜂的卵、幼虫、蛹以及0、5、10、15、20日龄的工蜂肠道DNA为模板,采用熊蜂β-actin为内参基因,对样品中的共生菌G. apicola和S. alvi进行荧光定量PCR分析,并比较不同日龄、不同虫态每微升肠道基因组DNA样品中检测到的细菌16S rDNA基因的拷贝数,分析共生菌数量在熊蜂生长发育过程中的变化。不同日龄、不同虫态之间相对表达量的显著性差异用软件SPSS19.0的单因素ANOVA方差分析进行统计。【结果】从文库中随机挑选213个单克隆进行测序,经过Chimeras分析后,共得到202个有效序列,这些序列共划分为16个OTU。测得的序列与登录的相应细菌16S rDNA序列的相似性在93%-99%。在克隆文库测得的细菌16S rDNA序列中,G. apicola占45%、S. alvi占30%、Bifidobacterium占10%、Fructobacillus fructose占5%、Lactobacillus占2%、Flavobacterium aciduliphilum占2%,其他细菌占6%。其中G. apicola和S. alvi为兰州熊蜂肠道内的主要共生菌,qPCR结果表明两种共生菌在不同日龄、不同虫态的熊蜂肠道内都能检测到,两种细菌的数量在熊蜂发育过程中的变化趋势相似,即先增加后减少,最后达到稳定状态。G. apicola和S. alvi在熊蜂的卵、幼虫和蛹中数量都较少,在5日龄时的数量达到峰值,显著高于其他日龄,之后又逐渐减少,在15日龄后趋于稳定,第15、20日龄之间差异不显著。【结论】人工饲养的兰州熊蜂肠道中主要有4个种属的常见共生菌：G. apicola、S. alvi、F. fructosus和Bifidobacterium,其中G. apicola和S. alvi是其体内的优势菌。G. apicola和S. alvi在熊蜂中都具有水平和垂直传播的特性,两种共生菌在熊蜂的卵、幼虫和蛹中都检测到,但数量较少,工蜂出房后细菌大量增殖并在出房15 d左右形成稳定的共生菌群。熊蜂生长发育过程中体内共生菌数量的变化可能与这两种细菌对熊蜂的作用有关。     

Histopathological Effects of the Protein Toxin from Xenorhabdus nematophila on the Midgut of Helicoverpa armigera

Xenorhabdus nematophila HB310, which is highly virulent for many insects, is symbiotic with Steinernema carpocapsae HB310. Toxin II was obtained using methods such as salting out and native-PAGE from the cells of X. nematophila HB310. The histopathology of toxin II on H. armigera larvae was studied by dissecting an olefin slice of the midgut. The symptoms showed that the histopathology of the H. armigera midgut was similar to that of other novel midgut-active toxins such as the δ-endotoxins from Bacillus thuringiensis, as well as Tca from Photorhabdus luminescens W14. The midgut tissues of H. armigera fourth-instar larvae began to transform after the oral intake of the toxin Ⅱ over 6 h. First, the anterior region of the peritrophic membrane （PM） began to degrade followed by the elongation of the columnar cells. The epithelium decomposed gradually, and the midgut tissues were either loose or disordered. The PM disappeared after 12 h but reappeared after 72 h following transient or sublethal exposure to the toxin Ⅱ. Toxin Ⅱ also directly destroyed in vitro PMs of H. armigera.     

黑曲霉拮抗菌Xenorhabdus bovienii445筛选、鉴定及发酵优化

【目的】从现有共生细菌资源中筛选对黑曲霉具有高拮抗作用的菌株,为寻求安全高效的生物保鲜材料提供更多选择。【方法】采用平板对峙法和琼脂扩散法,分别对现有昆虫病原线虫共生菌进行初筛和复筛,对筛选出的高效拮抗共生细菌进行生理生化以及16S rRNA 序列进化分析鉴定,通过单因素试验和响应面分析法优化菌株培养条件,利用损伤接种法在红地球葡萄上验证对黑曲霉防治效果。【结果】分离筛选共获得20株拮抗共生菌,复筛得到1株抑菌效果显著的共生细菌(445),经生理生化及分子生物学分析为伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii,GeneBank ID:OK560680,与菌株Xenorhabdus bovienii strain Xb139 (MG995576.1)聚于同一分支,相似性达99.79%。获得445菌株抑菌活性的最优培养条件为接种量3.06 %、pH 7.0、装液量100.15 mL/250 mL,抑菌圈直径为(29.67±0.28) mm,抑菌效价为10.59 cm/mL,比优化前提高39.16%。Xenorhabdus bovienii 445发酵液对黑曲霉具有较好防治效果,3 d后防效为63.50%。【结论】筛选得到1株高效拮抗黑曲霉的昆虫病原线虫共生细菌,其发酵液对黑曲霉有良好的抑制效果,具有较好的生防潜能。     

5株海洋微藻伴生细菌的分离鉴定与功能分析

[目的]研究水产养殖中常用的4种海洋微藻在粗放培养过程中所伴生的主要细菌。[方法]采用平板涂布的方法成功分离到5株可培养的海洋细菌,利用16S rRNA基因序列的通用引物对单克隆菌落进行PCR扩增,所得PCR产物经测序和Genbank比对后,采用邻位相接法构建了系统进化树,并对其种属关系进行了分析。[结果]研究表明,5株海洋细菌分属于α-proteobacteria和γ-proteobacteria两大类别。根据16S rRNA基因序列的种属关系分析,5株海洋细菌分属于Porphyrobacter、Devosia、Ponticoccus、Marinobacter和Roseobacter5个属。根据其相近种的生理生化特征推断,这些伴生细菌在分解微藻胞外产物为微藻提供无机营养盐和分泌促生长因子促进微藻的生长等方面可能发挥着重要作用。[结论]在实际的微藻饵料培养过程中,应注意保留这些有益的伴生细菌。