黄条鰤hsp70基因克隆及其在早期生长发育过程中的表达调控特性

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)在鱼类的应激与免疫反应中发挥重要的生理调控作用,HSP70是该家族的重要成员。为探讨热休克蛋白在大洋性经济鱼类黄条鰤 (Seriola aureovittata)生长发育中的生理作用,本研究克隆获得了黄条鰤hsp70基因的全长cDNA序列,并采用定量PCR技术测定了其组织分布及在早期生长发育过程中的表达特征。结果显示,黄条鰤 hsp70基因的cDNA序列全长为2 332 bp,其中,5′-UTR长度为187 bp,ORF长度为1 920 bp,3′-UTR长度为225 bp,编码639个氨基酸,蛋白质分子量为70.1 kDa,等电点为5.16。黄条鰤 hsp70 mRNA的组织表达具有性别二态性差异,其中,在雌性鳃、心、脾脏和卵巢组织中显著高表达(P<0.05),且以卵巢中表达量最高;雄性垂体、鳃、头肾和精巢组织显著高表达(P<0.05),且以鳃中表达量最高。胚胎发育过程的表达检测显示,在卵裂前的受精卵中可检测到hsp70的表达,表明其具有亲本遗传的特性。同时,在胚胎发育过程的各个时期都可检测到hsp70 mRNA的表达,且在低囊胚期之前的各发育阶段一直保持较低表达水平,在原肠前期开始显著上调表达(P<0.05),其后保持相对较高表达水平,至胚胎孵化出膜期达峰值。在仔稚幼鱼中,hsp70 mRNA在初孵仔鱼和1 d仔鱼中高表达,其后在4 d仔鱼中显著降低(P<0.05),其后显著上调表达,至15 d仔鱼达峰值,其后在20 d仔鱼显著下降,并在25 d后稚鱼和幼鱼中保持相对较低表达水平。研究结果可为深入认识黄条鰤hsp70基因的结构特征、发生发育及其早期生长发育阶段的表达调控功能提供依据。     

黄条鰤 npy基因克隆及其对饥饿再投喂的应答特性

为探究神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)在黄条鰤 (Seriola aureovittata)摄食调控中的作用及机制,本研究采用同源克隆的方法获得了黄条鰤 npy基因的开放阅读框(ORF)序列,并利用实时荧光定量PCR技术分析了npy基因的组织分布以及其对饥饿再投喂的应答特性。黄条鰤 npy基因ORF序列长度为300 bp,编码99个氨基酸的前体蛋白,其中包括28个氨基酸的信号肽、36个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列同源性比对发现,黄条鰤 npy编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)等其他硬骨鱼高度保守(>90%);系统进化树分析表明,黄条鰤 npy与高体鰤 (Seriola dumerili)的关系最近。npy mRNA在所检测的12种组织中均有表达,其中,在脑组织表达量最高,在垂体和胃中表达量次之。在饥饿再投喂实验中,饥饿刺激了npy mRNA的表达,特别是饥饿21 d时,实验组垂体npy mRNA表达量显著高于对照组,再投喂7 d后恢复到对照组水平。上述结果表明,npy可能参与了黄条鰤的摄食调控,在饥饿代谢补偿机制中发挥了重要作用。     

黄条鰤白介素-1β基因克隆及其免疫应答分析

白介素-1β是一种典型的促炎细胞因子,参与调控免疫细胞增殖、分化和凋亡等过程。本研究从黄条鰤(Seriola aureovittata)中鉴定到2个白介素-1β分子(分别命名为SaIL-1β1和SaIL-1β2)。SaIL-1β1全长cDNA序列为1 292 bp,开放阅读框长度为828 bp,编码275个氨基酸;SaIL-1β2 cDNA序列为1 337 bp,开放阅读框长度为960 bp,编码319个氨基酸。SaIL-1β1和SaIL-1β2编码的蛋白均含有IL-1保守的结构域和12个β折叠,具有结构上的保守性。组织表达分布显示,SaIL-1β1在头肾中表达量最高,脾脏和肝脏次之;而SaIL-1β2在鳃中表达量最高,头肾和脾脏次之。脂多糖(LPS)刺激后,SaIL-1β1和SaIL-1β2在头肾和脾脏中的表达量均显著增加。在头肾中,LPS刺激后6 h,SaIL-1β1急剧上升至对照组的10.03倍(P<0.05),随后逐渐回落,在12、24、48、72 h分别为对照组的7.15、4.09、2.71、3.03倍(P<0.05);在刺激后6 h,SaIL-1β2表达量急剧上升至对照组的11.49 倍(P<0.05),最后逐渐回落,48 h恢复至正常水平,72 h下降至对照组的0.29倍(P<0.05)。脾脏中,LPS刺激后6 h,SaIL-1β1表达量急剧上升至对照组的6.59倍(P<0.05),随后逐渐回落;SaIL-1β2转录水平表达模式与SaIL-1β2相似。综上,本研究在黄条鰤中鉴定了2种白介素-1β分子,并探讨了其在免疫应答中的表达规律,为研究白介素-1β分子在黄条鰤抗菌免疫中的作用提供了基础。     

黄条鰤胚胎发育和早期仔鱼生长的温盐适应特性

采用实验生态学、形态测度和分子生物学的方法,研究了温度、盐度对大洋性经济鱼类黄条鰤(Seriola aureovittata)胚胎孵化率、初孵仔鱼畸形率、内源性营养吸收利用、生长基因表达、存活指数(SAI)和饥饿不可逆点(PNR)的影响,并对早期仔鱼活力进行了评价。结果显示,在最适水温20~22 ℃条件下,胚胎孵化率最高,达75%~81%,且初孵仔鱼畸形率低于6.7%,胚胎发育的温度系数Q10值最接近2,且初孵仔鱼全长和卵黄囊体积最大。受精卵在盐度＞30时漂浮在水面,而在盐度为20~25时悬浮在水中,在盐度为10~15时下沉于水底部。受精卵胚胎发育的最适盐度范围为30~35,胚胎孵化率达79%~80%,初孵仔鱼畸形率低于6.0%。在4个不同温度条件下(18、20、22、24 ℃)初孵仔鱼卵黄囊吸收利用速率随着温度的升高而加快。不同盐度条件下,初孵仔鱼的SAI值表明,盐度为30~35时,仔鱼的SAI值较高且峰值出现在盐度为30组,而盐度为10组仔鱼SAI值最低。在水温为20~22 ℃时,6 d仔鱼的初次摄食率最高(78%),PNR出现在7~8 d。初孵仔鱼在水温为20~24 ℃、盐度为30~35条件下,IGF-1 mRNA表达水平显著高于其他实验组。饥饿条件下,IGF-1 mRNA在饥饿后第2天显著升高,其后在第3~4天显著下降,但仍保持较高表达水平,随着饥饿的进行继续下降至显著低于开口期表达水平。本研究明确了黄条鰤受精卵孵化的最适温度为20~22 ℃、最适盐度为30~35,并建立了初孵仔鱼活力评价的指标,研究结果可为建立规范化的黄条鰤胚胎孵化和苗种培育技术提供依据。     

黄条鰤生长性状全基因组关联分析

利用2b-RAD技术对119尾黄条鰤(Seriola lalandi)个体进行测序,共获得黄条鰤SNP分子标记26665个,对黄条鰤个体的体质量和全长这2个重要生长性状进行全基因组关联分析,筛选与体质量和全长性状相关的SNP位点和候选基因。结果显示,黄条鰤体质量性状中共筛选到17个体质量显著关联的SNP位点,找到17个可能的候选基因,全长性状共筛选到12个潜在显著关联位点,找到12个可能的候选基因。利用KEGG数据库对可能的候选基因进行Pathway分析,得知候选基因主要参与了细胞或组织生长发育相关的代谢通路调控过程,可能是影响黄条鰤生长性状密切相关的重要候选SNP位点和功能基因,结果可为今后黄条鰤种质资源可持续利用和育种提供遗传信息资料积累。     

两种养殖模式下黄条鰤幼鱼消化道菌群对生长的微生态调控作用

探究了工厂化、网箱养殖模式对黄条鰤(Seriola lalandi)幼鱼生长性能及消化道菌群的影响, 通过 16S rRNA 高通量测序和生物信息学方法, 分析了两种养殖模式下黄条鰤幼鱼消化道(胃、幽门盲囊、肠道)、饵料及养殖水中的菌群结构特征及其互作关系。结果显示, 本实验条件下, 网箱养殖黄条鰤幼鱼较工厂化养殖鱼生长性能显著提升; 在黄条鰤幼鱼消化道菌群方面, 门水平上的拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和属水平上的拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)在网箱养殖模式中其丰度值高于工厂化养殖模式, 其中拟杆菌属仅出现于网箱养殖模式且呈现显著性差异; Beta 多样性分析显示消化道菌群更多受到饵料菌群的影响, 受水环境影响相对较小。KEGG 注释分析表明两种养殖模式的差异菌群中, 网箱养殖幼鱼消化道菌群主要参与磷酸转移酶系统 (PTS)和 NOD 样受体信号通路, 而工厂化养殖幼鱼为碳水化合物代谢和类胡萝卜素合成通路。本研究表明, 环境菌群中, 饵料菌群对消化道菌群的影响大于养殖水体菌群; 消化道微生物群落通过调整其组成结构从而改变菌群功能通路的方式, 积极参与两种养殖模式下黄条鰤幼鱼生长机能差异的调控。因此, 网箱养殖鱼表现出更快速的生长性能可能是由于机体内的菌群产生了更多的短链脂肪酸并诱导 IGF-1 等生长相关功能基因的表达, 从而促进机体的营养吸收和生长。本研究预期结果将为黄条鰤专用配合饲料的研制和健康养殖技术开发提供微生态理论支撑。     

工厂化养殖密度对黄条鰤生长和生理特性的影响

养殖密度是水产养殖管理中一项非常重要的参数, 适宜的养殖密度能够降低养殖动物的应激胁迫水平, 促进其健康、快速生长。为探究黄条鰤(Seriola lalandi)在陆基工厂化养殖条件下的最适密度, 本研究对 1 龄黄条鰤 [(565.83±70.22) g]开展为期 60 d 的养殖实验, 共设置 10 尾/m³ (低密度组)、20 尾/m³ (中密度组)和 30 尾/m³ (高密度组) 3 个密度组。实验过程中测量并计算包括增重率、特定生长率、肥满度和肝体指数在内的生长指标, 并检测血液生理、血清生化、肝脏和肾脏组织的非特异性免疫酶活性等指标。结果表明, 中、高密度组黄条鰤的增重率、 特定生长率在第 60 天时均显著低于低密度组对应的数值(P＜0.05); 在 3 个密度组中, 低密度组的特定生长率在 60 d 时显著高于 30 d 的数值(P＜0.05), 中密度组的特定生长率在 60 d 与 30 d 之间差异不显著(P＞0.05), 高密度组的特定生长率在 60 d 时低于 30 d 的数值, 说明高密度养殖对黄条鰤的生长产生了的胁迫。整个实验过程中, 血清中肾上腺素和皮质醇等的含量在 30 d 和 60 d 时均随养殖密度的增加而显著升高(P＜0.05), 生长激素和类胰岛素生长因子 Ⅰ的含量呈相反趋势; 肝脏和肾脏中超氧化物歧化酶、溶菌酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和丙酮酸激酶的活性在 30 d 和 60 d 时整体呈现随养殖密度的增加而显著升高的趋势(P＜0.05), 说明高密度养殖对黄条鰤的生理造成了胁迫。由此可见, 从生长、生理和生产实践角度综合评价, 中密度(20 尾/m³ )是 1 龄黄条鰤工厂化养殖的适宜密度, 相关研究结果将为黄条鰤工厂化养殖技术进一步完善提供参考。     

黄条鰤早期生长发育特征

观察和记录了黄条鰤(Seriolaaureovittata)早期生活史阶段生长发育的形态与数量特征,描述了胚胎和仔稚幼鱼各发育阶段的表观特征与生长特性。黄条鰤成熟卵子为透明的圆球形浮性卵,卵径(1.48±0.04)mm,单油球,油球径(0.37±0.02) mm。在水温(21.5±0.5)℃,盐度32, pH 8.0～8.2条件下,受精卵历经73 h 40 min破膜孵化。初孵仔鱼全长(4.23±0.39) mm,卵黄囊长椭圆形,长度约为全长的1/3。3日龄仔鱼全长(4.61±0.43) mm,开口,卵黄囊消耗95%,眼睛变为黑色,鳔原基形成。4日龄仔鱼全长(4.57±0.88) mm,肛门与外界联通,开始摄食轮虫。5日龄仔鱼全长(4.68±0.25) mm,卵黄囊耗尽,鳔开始充气。油球在8日龄消耗完毕,仔鱼全长(5.14±0.36) mm,完全进入外源性营养阶段。7日龄仔鱼全长(4.79±0.36) mm,鳔充气变为亮泡状。初孵仔鱼消化道细而直,随着仔鱼发育,消化道变得粗大,肠道内褶回增多,在10日龄仔鱼全长(5.19±0.37)mm,形成第一个肠道生理弯曲,15日龄仔鱼全长(5.71±0.50)mm,形成第二个肠道生理弯曲,消化能力不断增强。脊椎末端弯曲在15日龄开始,至25日龄全长(8.66±1.06)mm,弯曲过程完成。35日龄稚鱼全长(20.04±1.56)mm,各鳍条数与成鱼一致。60日龄幼鱼全长(65.06±1.94) mm,鳞片形成。80日龄幼鱼全长(134.05±3.25) mm,体表出现一条纵向横贯眼睛和尾椎末端的浅黄色色素带,在体态上与成体无明显区别。     

5-HMF对黄条鰤生长、肠道组织结构及生理特性的影响

为了分析在饲料中添加5-HMF (5-羟甲基糠醛)对黄条鰤(Seriola aureovittata)幼鱼生长、肠道组织结构、血清生化特性、消化道菌群结构等方面的影响,选用360尾平均体重(82.33±2.75)g的黄条鰤,随机分为4组(M0组、M1组、M2组、M3组),每组3个重复,每个重复30尾鱼,M0组为对照组,投喂基础饲料,M1组、M2组、M3组分别投喂添加5-HMF (添加量分别为0.25%、0.5%、1%)的基础饲料,实验持续6周。结果显示:体外Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞)增殖实验表明,本研究所用5-HMF浓度在安全范围内;M2和M3组实验鱼的增重率和特定生长率显著高于M0组(P<0.05),且M2组肥满度显著高于M0组(P<0.05);M2组实验鱼肠道肌层厚度和绒毛高度显著高于M0组(P<0.05); M2和M3组血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于M0组(P<0.05),而丙二醛(MAD)水平显著降低(P<0.05); M2和M3组实验鱼血清免疫球蛋白M(IgM)和碱性...     

MS-222和丁香油对黄条鰤麻醉效果研究

黄条鰤(Seriola aureovittata)是一种全球水域广泛分布的具有长距离洄游特性的大型大洋性鱼类,其生性凶猛、游泳速度快,人工养殖条件下对环境刺激的应激反应强烈。为开发适宜黄条鰤实验和生产操作的低应激处理技术,采用实验生态学、生理学手段,首次研究了2种温度条件下(20℃和24℃)、2种麻醉剂(MS-222和丁香油)对1龄黄条鰤的麻醉效果,通过行为判别与生理指标分析(皮质醇、肾上腺素和葡萄糖的水平),确定了2种麻醉剂对黄条 的最适麻醉时间、复苏时间和麻醉剂量。根据黄条鰤麻醉和复苏时的行为特征,将麻醉过程分为7个时期,复苏过程分为6个时期。在水温为20℃和24℃时,MS-222麻醉黄条 的最佳浓度分别为100~120 和100 mg/L,而丁香油的最佳浓度均为40 mg/L。在此条件下,实验鱼均可在3 min之内入麻,5 min之内复苏。随着麻醉剂浓度的增加,黄条鰤入麻时间呈缩短趋势,复苏时间呈延长趋势。水温的升高降低了入麻时间,而对复苏时间无明显影响。在水温20℃和24℃条件下,40 mg/L的丁香油麻醉黄条鰤后,血清皮质醇水平分别于6 h和12 h达峰值;在水温24℃条件下,100 mg/L的MS-222麻醉黄条鰤后,血清肾上腺素水平于12 h达峰值,其他各实验组血清肾上腺素、葡萄糖和皮质醇水平均在24 h达峰值。2种温度条件下,实验鱼血清中3种应激相关生理指标在复苏72 h后均显著降低至初始水平以下。本研究结果可为制定规范化的黄条鰤实验与养殖生产操作技术提供参考依据。     

合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析

以合浦珠母贝(Pinctada fucata)转录组中的matrilin-1基因片段为基础,开展了matrilin-1的c DNA全长(Pfmatrilin-1)克隆和定量表达分析。Pfmatrilin-1基因c DNA全长2 036 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 194 bp,编码397个氨基酸,包括1个信号肽序列和2个血管性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域。系统进化分析显示无脊椎动物的matrilins与脊椎动物的matrilins进化关系较远。荧光定量PCR表达分析结果显示,Pfmatrilin-1 mRNA在合浦珠母贝各个组织中均有表达,其中在血液中表达量最高(P0.05);Pfmatrilin-1从担轮幼虫期至变态期均有表达,眼点期表达量最高(P0.05),而贝类幼虫发育到眼点期就会开始附着,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,因此推测其可能与次生壳的形成有关。这些结果表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝生物矿化中发挥重要作用。     

Ambient salinity and osmoregulation,energy metabolism and growth in juvenile yellowtail kingfish (Seriola lalandi Valenciennes 1833) in a recirculating aquaculture system

The effects of salinity on plasma osmolality, branchial chloride cell density, feed consumption and conversion and growth performance of yellowtail kingfish (Seriola lalandi) were evaluated. Fish (11.6 ± 0.6 g) were kept for 29 days at 14, 18, 22, 26 (experimental) and 30 g L^?1 (control) salinity in independent, pilot‐scale recirculation aquaculture systems. No differences in plasma osmolality or chloride cell numbers in gills were observed, pointing to a strong osmoregulatory capacity in the juveniles. Fish at 14, 18 and 22 g L^?1 (7.61 ± 0.19, 7.61 ± 0.01 and 7.61 ± 0.13% day^?1, respectively) had higher growth rates than fish at 26 and 30 g L^?1 (7.10 ± 0.05 and 6.97 ± 0.06% day^?1 respectively). The higher growth rate at lower salinity resulted from increased feed intake; feed conversion was not different. An evaluation of the impact of salinity on growth rate of on‐growing stages (till market size) seems warranted to assess whether the profitable effects of low salinity persist in later stages of this important aquaculture species.     

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。     

牙鲆胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1 cDNA全长的克隆及表达分析

利用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条鰤、黄金鲈、红点鲑、鲤鱼和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-PCR分析表明,牙鲆IGFBP-1基因存在母源转录本,合子基因在孵化前的胚胎阶段及早期仔鱼中仅有较低水平的表达,在后期仔鱼中表达逐渐增高;牙鲆IGFBP-1基因在肝脏中表达量最高,在胃、脾、肠、性腺、肾、鳃、脑、心脏和肌肉中也有不同程度的表达。     

Temperature and dissolved oxygen influence growth and digestive enzyme activities of yellowtail kingfish Seriola lalandi (Valenciennes, 1833)

A 5 week experiment was carried out with juvenile yellowtail kingfish Seriola lalandi to investigate the interactive effects of water temperature (21, 24, or 27°C) and dissolved oxygen regime (normoxic vs. hypoxic) on the growth rate, feed intake and digestive enzyme activity of this species. Specific growth rate (SGR) was highest at 24°C, regardless of oxygen regime, but the SGRs of the fish exposed to hypoxia at 21, 24 and 27°C were 13%, 20% and 17% lower, respectively, than the SGRs recorded for the fish reared under normoxic conditions. The digestive enzyme activities (i.e. trypsin, lipase and α‐amylase) were influenced by temperature but did not appear to be affected by dissolved oxygen concentration. Information about the effects of water temperature and dissolved oxygen on feeding, growth and digestive capacity of juvenile yellowtail kingfish could contribute to improving feed management decisions for production of this fish species under different environmental conditions.     

Effect of fish oil replacement and probiotic addition on growth,body composition and histological parameters of yellowtail (Seriola dumerili)

Fish (175 g of initial weight) were fed in triplicated groups with four diets formulated by 0% (FO 100), 75% (FO 25) and 100% (with and without probiotics, FO 0 and FO 0+) of fish oil replacement consisting of a mixture of linseed, sunflower and palm oils. After 109 days, growth and nutritional parameters were not affected by the treatment; however, fish fed with 0% of fish oil showed the lowest survival rate and without differences between the same diet with probiotics. As for biometric parameters, significant differences in the viscerosomatic index (VSI) were observed between fish fed the FO 0+ diet and the FO 100 and FO 25 diets. Results obtained from histological analysis did not detect inflammation in gut samples, while liver samples showed a remarkable steatosis in all four treatments. Total fish oil replacement produced a significant difference in the width of the lamina propria. The dietary inclusion of probiotics in the FO 0+ diet seems to favour a recovery of intestine histology. In addition, as fish oil substitution increased, the width of the lamina propria also increased. In conclusion, it is possible to affirm that the four diets administrated to Seriola dumerili did not compromise the correct development of the animals.