黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

海菜花ISSR-PCR反应体系的优化与引物筛选

为建立海菜花ISSR-PCR最优反应体系并筛选出适宜的ISSR-PCR引物,本研究应用L₁₆(3⁴)正交设计试验和单因素实验,筛选ISSR-PCR反应体系中主要参数(引物, 2×Taq Master Mix,模板DNA)的最适浓度。结果表明,海菜花最适ISSR-PCR反应体系为引物0.22 ng, 2×Taq Master Mix 1.5 U/25μL、模板DNA24 ng。通过最优反应体系进行引物筛选,获得19条适宜海菜花扩增的ISSR引物,并利用10个地理居群的海菜花DNA对该体系进行验证。本研究对海菜花后续的遗传多样性、遗传图谱构建提供参考。     

块根紫金牛ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立块根紫金牛ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即25 ul的体系中含Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP0.15 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,模板DNA50ng,10×Buffer 2.5μl.适宜的扩增程序是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56.6℃退火45s,70℃延伸2.0 min;45个循环;72℃延伸7min,4℃保存.采用正交和单因素试验可快速建立ISSR-PCR反应体系.该体系稳定、可靠,可用于块根紫金牛遗传多样性分析.     

新疆野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合新疆野生欧洲李的ISSR-PCR反应体系,本研究以野生欧洲李为供试材料,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验设计相结合的方法,对影响野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的5个因素(DNA模板,Taq酶,dNTPs,引物,Mg2+)进行筛选与优化,对16条引物的退火温度进行筛选.结果表明,Taq酶对PCR扩...     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(4^5）对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg^2 ,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析：①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20μl)为：Taq酶1．0U,Mg^2 2．0mmol/L,模板DNA50-200ng,dNTP0．15mmol/L,引物0．31μmol／L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58．3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L16(45)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化.结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-P...     

壳菜果ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立一个稳定、可重复的壳菜果ISSR-PCR反应体系,以壳菜果的总DNA为实验材料,通过单因素实验、正交试验和方差分析对模板DNA浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度5因素进行研究,确定了壳菜果ISSR-PCR反应的最优体系为：在20 μL的反应体系中模板DNA为30 ng,dNTPs浓度为0.20 mmol/L,Mg2+浓度为2.75 mmol/L,引物浓度为0.6 μmol/L,TaqDNA聚合酶为2.2 U。方差分析表明：5个因素中只有Mg2+浓度对反应体系影响最大,达到了显著性水平。     

芒草ISSR分子标记体系的确定及引物的筛选

为建立并优化适用于芒草的ISSR-PCR扩增反应体系,进一步研究野生芒草群体的遗传多样性水平。以吉林省采集的芒草(Miscanthus sinensis)为材料,采用单因子试验的方法研究模板DNA、TaqDNA聚合酶的用量及引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响。结果显示：在20 μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。此外,筛选到10 条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

金莲花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L₁₆(4⁵)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg²⁺、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg²⁺浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg²⁺1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

马铃薯SSR-PCR反应体系的建立和优化

应用L16(45)正交设计对影响马铃薯SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于马铃薯SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响。马铃薯SSR-PCR优化反应体系为:10×PCR Buffer 1.0μl、模板DNA约30 ng、dNTP 200 mol/L、SSR引物66 ng、Taq DNA聚合酶0.25 U、Mg2+2.25 mmol/L,加ddH2O至终体积10.0μl。PCR扩增程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸10 min,然后4℃保存。