黄河中游粗山羊草三种y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析

粗山羊草(Aegilops tauschii, 2n = 2x = 14, DD)是六倍体普通小麦的祖先之一,其高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)变异类型丰富,是小麦品质改良的重要基因资源。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了黄河中游地区161份粗山羊草的HMW-GS,发现3种编码序列未知的y-型亚基,即Dy10.5^t、Dy10.4^t和Dy10.5^*t亚基。通过AS-PCR扩增、克隆、测序和氨基酸序列推导,发现3种未知序列均具有典型HMW-GS的序列结构特征且较为相似,仅Dy10.4^t与Dy10.5^t亚基存在一个氨基酸重复单元的缺失,Dy10.5^t与Dy10.5^*t亚基在信号肽部位有一个氨基酸的替换(L-F)。通过对这3种HMW-GS与32个已知氨基酸序列的HMW-GS多序列比对和系统进化关系分析,证实Dy10.5^t、Dy10.4^t和Dy10.5^*t 3个亚基是D基因组编码的高分子量谷蛋白y-型亚基家族的新成员。     

黄河中游地区粗山羊草高分子量谷蛋白亚基组成分析

为了解黄河中游地区粗山羊草的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)遗传多样性,应用SDS-PAGE技术分析了56份粗山羊草Glu-Dt1位点的HMW-GS组成,检测到3种x-型亚基(5t,6.2t,null)和3种y-型亚基(10.5t,10.4t,10.3t)。其中6.2t类型是新的x-型亚基。供试粗山羊草共发现3种HMW-GS组合类型5t 10.5t,6.2t 10.4t,null 10.3t,它们的比例分别是91.07%,7.14%,1.79%。表明该地区粗山羊草的高分子量谷蛋白亚基有一定变异。     

东北春小麦及部分外引小麦高分子量谷蛋白亚基组成分析

利用SDS-PAGE法分析了72份东北春小麦品种(系)和外引小麦品种HMW-GS组成及分布,结果表明:在Glu-A1位点上的3种变异类型null,1和2*亚基中,东北春小麦1和2*亚基出现的频率最高,均为36.1%,外引品种中null出现的频率最高,为41.7%;在Glu-B1位点上,检测到的6种变异类型(7,6 8,7 8,7 9,14 15,17 18)中7 8亚基类型的出现频率最高,东北春小麦为66.7%,外引品种为44.4%;在Glu-D1位点上的3种变异类型(2 12,2 10,5 10)中5 10出现频率最高,东北春小麦为55.6%,而外引品种高达72.2%。所有参试材料中共出现19种组合类型,其中出现频率最高的是1,7 9,5 10和null,7 8,2 12,均为19.4%。根据Payne的品质评分标准对部分材料进行评定,发现达到10分的材料出现了23份。这些材料可能成为东北春麦区小麦品质改良的宝贵资源。     

小麦高分子量谷蛋白亚基功能的体外鉴定

通过SDS-PAGE方法回收纯化小麦高分子量谷蛋白亚基1Ax1、1Dx5、1Dy10、1Bx7、1By8和1By9,然后利用微量配粉方法将单个亚基分别添加到对照“京411”面粉中,经过揉混仪分析单个亚基对揉面特性的影响,进而确定各个亚基的功能特性。根据揉面时间、稳定时间等参数的变化,6个小麦高分子量谷蛋白亚基对面粉品质的影响表现为1Dy10 > 1Ax1 > 1Dx5 > 1By8 > 1Bx7 > 1By9。研究结果表明,通过揉混仪进行体外配粉检测是快速鉴定高分子量谷蛋白亚基功能的一种有效方法。     

小麦地方品种高分子量谷蛋白亚基多样性分析

采用SDS-PAGE方法,对我国9个麦区的76份代表性地方品种的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成比较分析,并探讨其与环境因素(平均海拔、年平均降雨量和年平均温度)的相关性。结果表明,25.0%的品种具有异质性,分别包含2~4种不同HMW-GS组合;在Glu-1位点共检测到14个等位变异,其中Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1等位变异数分别为2、7和5;发现了3个新等位变异,包括Glu-B1位点2个和Glu-D1位点1个。所有等位变异构成16种不同的亚基组合类型,以(N, 7+8, 2+12)为主,频率为69.7%。在Glu-1位点上,不同麦区遗传多样性分布存在一定的不均衡性,年平均降雨量和年平均温度与麦区多样性指数呈负相关。推测环境压力可能是地方品种多样性地区分化的重要因素。     

引进小麦种质材料的高分子量谷蛋白亚基分析

为了有效利用多年来引自俄罗斯及中亚地区的小麦资源,了解引进材料的遗传基础,特别是品质基础,采用SDS-PAGE技术对102份小麦材料的高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）组成进行了分析。结果表明,参试材料中共检测到11种HMW-GS类型,Glu-A1位点上有1、2＊、Null,Null位点相对比较多,为40.20%;Glu-B1位点上有7、7＋8、7＋9、6＋8、17＋18,以7＋9为主要类型（59.80%）;Glu-D1位点有2＋12、2＋12’、5＋10三种类型,其中5＋10所占比例为51.96%。参试材料共检测到16种亚基组合,其中＂Null,7＋9,2＋12＂所占比例较大,为25.5%。值得一提的是,参试材料中品质评分为10分的材料有22个,9分的有29个。这些材料有可能会成为比较有价值的品质改良中间材料。     

山羊草(Aegilops)十个种的高分子谷蛋白亚基分析

利用SDS－PAGE技术对山羊草属10个种的51份材料进行高分子谷蛋白亚基电泳分析。结果表明，10个种各电泳出2－6条带，共17种类型，每个种有1－4种类型。其中，有两种（或以上）类型的种均为四倍体种。种内带型内差异较小，种间差异较大，并且，各个种之间没有相同的类型。     

部分山东小麦高分子量谷蛋白1Bx14亚基特异PCR标记分析

在1Bx14亚基的基因序列的基础上,选取不同位点设计特异引物,从中筛选出了一对引物,对HMW-GS在Glu-Bx1位点已知的10个小麦品种进行了PCR扩增。结果表明:凡具有1Bx14亚基的4个品种都能扩增出一条1256bp左右的特异带,而不具该亚基的品种则未能扩增出这一特异带。用这一特异标记对山东省种植面积较大的40个品种进行PCR检测,发现仅有5个品种携带1Bx14亚基。该标记可用于检测小麦品种在这一位点的亚基组成,与SDS-PAGE相比,可显著提高检测的准确性和效率。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5′上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板,用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS12)的上游调控序列。序列测定结果表明:所克隆的启动子片段大小为917 bp,该片段的498~922 bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较,同源性为97.9%,有9个核苷酸发生了改变。推测的TATA box位于836~841 bp,有3个CAAT-like box,分别是693 bp处的CCAA;730 bp处的CAAAT和808 bp处的CCAT。另外,在684 bp存在E-box(TGCAAAG),还有2个E-like box,分别是608 bp处的TGCAAAC和510 bp处的TGCAAAA。认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关。     

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

高分子量麦谷蛋白亚基、1B·1R易位系、多酚氧化酶(PPO)活性及黄色素含量等基因对小麦加工品质有重要影响,准确、快速鉴定这些基因对品质改良有重要意义.本研究对新疆当地及国内外引进的321份小麦品种进行SDS-PAGE分析,利用特异性分子标记对高分子量谷蛋白亚基中的Dx5、Bx7、By8、By9亚基、1B·1R易位系、PPO和黄色素含量基因进行鉴定.进一步验证分子标记检测的可靠性和准确性,为优质小麦分子标记辅助育种提供材料和方法.SDS-PAGE分析表明,供试材料有21种亚基类型,其中Glu-A1位点有3种类型,以null为主;Glu-B1位点有10种类型,Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位;Glu-DJ位点有8种类型,Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位.分子标记检测表明,Dx5亚基的频率为38.3%,Bx7亚基的频率为85.7%,By8亚基的频率为38.9%,Bx9亚基的频率为42.7%;特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE鉴定结果的吻合率分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%.在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中,1B·1R易位系材料的频率分别为22.0%、31.5%和25.0%,Psy-A1b的频率分别为9.0%、10.8%和5.4%,Ppo-A1b的频率分别为38.0%、43.8%和45.7%,Ppo-Dla的频率分别为48.0%、66.9%和40.2%.同时含Ppo-A1b和Ppo-D1a的材料有74份,占23.0%.本试验中采用的基因特异性标记重复性好、准确率高,可有效用于小麦品质分子标记辅助选择.     

基于相对迁移率的节节麦高分子量谷蛋白亚基组成分析

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是影响小麦烘烤品质的重要因素.新的HMW-GS变异类型的发现和利用,有助于优质小麦品种的培育.然而,目前HMW-GS新变异类型众多、对照标准材料多样,导致传统数字命名系统分辨率严重降低.本研究通过利用HMW-GS的条带与中国春1Dx2条带的迁移率比值作为相对迁移率来表示亚基类型,进而提...     

Identification and isolation of a new x-type HMW glutenin subunit 1Dx1.6t gene from Aegilops tauschii

A new x-type HMW glutenin subunit, designated as 1Dx1.6^t from Aegilops tauschii was identified and characterized by SDS-PAGE and MALDI-TOF-MS. This subunit is located between 1Dx2 and 1Dx1.5^t and possesses a molecular mass ( M _r) of 88565.8 Da. Its complete coding sequence was amplified via allele-specific PCR (AS-PCR), and the amplified product was cloned and sequenced. The authenticity of the cloned 1Dx1.6 ^t gene was confirmed by successful expression of its open reading frame in Escherichia coli. The molecular characterization of 1Dx1.6 ^t gene showed that its coding region consisted of 2541 bp encoding a polypeptide of 845 amino acid residues. Sequence comparison to previously characterized 1Dx1.5^t subunit which is related to good dough quality of bread wheat indicated that the 1Dx1.6^t subunit displayed high homology, but possesses 14 residue substitutions and a nonapeptide insertion. A total of 12 single-nucleotide polymorphisms (1 per 212 bp) was identified in the 1Dx1.6 ^t allele (11 in repetitive domain and 1 in the C-terminal domain), which could facilitate the design of AS-PCR markers.     

山羊草谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及表达分析

谷胱甘肽S-转移酶是一种多功能蛋白酶,在植物体内参与干旱、盐、低温、重金属等多种非生物胁迫的调节;山羊草是普通小麦D染色体组的供体物种,深入挖掘山羊草中GST基因,对进一步分析六倍体小麦GST基因的功能具有重要意义。本研究利用信息生物学手段,在山羊草中共发现114条GST基因序列,分属于6个亚族;基因复制分析发现共4对基因发生了基因复制,且均为纯化选择;采用荧光定量PCR对部分GST基因在非生物胁迫下的表达分析发现,8个GST基因在响应干旱和盐胁迫时,主要在根部显著上调表达,3个GST基因在响应低温胁迫时,在根和叶中均显著上调表达,说明山羊草中的GST基因在应答非生物胁迫时,在不同组织中的表达存在着差异。     

普通小麦及近缘粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克降、定位与进化分析

通过特异PCR引物设计,从普通小麦品种(豫麦34和烟农19)和粗山羊草(T9、T197、T48、T176和T17)中扩增、克隆了7个新的α-醇溶蛋白基因,分别命名为Gli-YM34、Gli-YN19、Gli-T9、Gli-T197、Gli-T48、Gli-T176和Gli-T17,基因序列长度为846~891 bp,编码282~297个氨基酸残基,都具有α-醇溶蛋白的典型结构特点。其中Gli-YM34和Gli-YN19基因推导的醇溶蛋白都含有一个额外的半胱氨酸残基,可能对面筋品质有正向作用。根据α-醇溶蛋白氨基酸序列所具有的4种T细胞抗原表位和多聚谷氨酰胺重复区的平均长度以及中国春缺体四体分析,将来自普通小麦品种的Gli-YM34和Gli-YN19基因定位在6D染色体上的Gli-D2位点,而且Gli-YM34和Gli-YN19与来自粗山羊草的α-醇溶蛋白基因具有很高的序列相似性,进一步证明粗山羊草是普通小麦D基因组的供体。在克隆的4个典型α-醇溶蛋白基因中检测到21个SNP和1个9 bp的缺失。系统进化分析表明,α-醇溶蛋白基因与低分子量谷蛋白亚基基因关系较近,在大约43.69百万年时分化,与ω-醇溶蛋白和HMW-GS基因亲缘关系较远,它们的分化时间大约为79.39百万年。     

Molecular cloning and characterization of six novel HMW‐GS genes from Aegilops speltoides and Aegilops kotschyi

Six novel high molecular weight glutenin subunits (HMW‐GS) from Aegilops speltoides (SS, 2n = 2x = 14) and Aegilops kotschyi (UUSS, 2n = 4x = 28) were identified by SDS‐PAGE and designated as ASy15*, AKx1*, AKx3*, AKx2.3, AKy20* and AKy8*, respectively. Their complete open reading frames (ORFs) were cloned and sequenced by allele‐specific PCR (AS‐PCR). Sequence comparison demonstrated that these novel genes displayed high single‐nucleotide polymorphisms (SNP) and InDel variations. In particular, AKy8* had an extra cysteine residue at position 140 in the central repetitive domain, while AKx2.3 had an unusually long repetitive domain (816 aa), which might have positive effects on gluten quality. Phylogenetic analysis showed that AKx1* and AKx3* belonged to the 1S genome, AKx2.3 to the 1U genome, and AKy20* and AKy8* most likely to the 1S genome. The divergence between the 6 HMW‐GS genes from the two Aegilops species and those from Triticum species occurred 4.77–23.54 MYA. The authenticity of these isolated endogenous HMW‐GS genes was confirmed through heterologous expression in Escherichia coli and Western blotting.     

小麦高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的定量分析

利用RT-PCR的方法研究小麦籽粒灌浆期高分子量谷蛋白12亚基基因mRNA的表达水平。东农7742的12亚基在开花后第6天出现mRNA的表达，花后14d表达量最高。新克旱9的12亚基mRNA的表达出现在开花后第10天，第18天表达量达最高。在籽粒灌浆的各个时期，东农7742的12亚基基因的mRNA的表达量均明显高于新克旱9。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.     

夹竹桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

首次从夹竹桃中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为NoPAL1,GenBank登录号为AY747677,这也是首次从夹竹桃花青苷代谢途径中克隆得到的基因。NoPAL1长866个bp,编码289个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现NoPAL1与其他植物的PAL基因高度同源。NoPAL1编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点。PAL系统进化树表明,NoPAL1与乔木类植物的PAL基因聚类关系最近。克隆NoPAL1基因为利用基因工程技术来调控夹竹桃花青苷的代谢从而调控夹竹桃花的颜色提供了基因资源。