牦牛FSHR基因5’端部分序列克隆及生物信息学分析

利用PCR和T—A克隆技术,测定了麦洼牦牛和杂种犏牛的FsHR基因5’端侧翼区和第1外显子的核苷酸序列,并运用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息学软件与其他物种的相应序列进行了同源性比对分析,为牦牛FSHR基因结构、犏牛雄性不育、牦牛遗传多样性,以及FSHR基因与牦牛的繁殖、产肉、产奶性状相关分析提供了理论基础。结果表明：牦牛和犏牛FSHR基因5’端侧翼区长度为970bp,普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981bp,序列长度差异较小;序列突变以碱基替换为主,牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪的核苷酸序列一致性分别为99．4％、99．3％、98．2％、96．9％,一致性较高,为同源基因。聚类分析中牦牛与犏牛首先相聚,再依次与普通牛、羊、猪聚在一起。根据核苷酸序列推测,氨基酸组成分析显示,牦牛和犏牛的该蛋白疏水性,蛋白的亲水性和稳定性较差,为不稳定的脂溶性蛋白;二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。     

马鹿茸IGF-1基因5′端克隆及生物信息学分析

对鹿茸IGF-1 5′端调控序列进行生物信息学分析。提取鲜马鹿茸顶部组织基因组DNA,设计简并引物,利用PCR获得马鹿茸IGF-1 5′端调控序列及部分外显子(命名为CCS1074),用DNAMAN软件进行CCS1074与其他种属IGF-1基因的序列同源性分析;使用在线分析程序预测CCS1074的潜在转录因子结合位点并比较分析鹿茸区别于其他种属IGF-1的特有潜在转录因子,进行TATA box、CpG岛、候选启动子区段及信号肽预测。结果获得了包含部分外显子的鹿茸IGF-1基因5′端(Genbank Accession No.DQ234266);序列同源性分析表明鹿茸IGF-1与牛、羊IGF-1基因5′端存在差异;生物信息学分析表明:在CCS1074 180~310 base处存在CpG岛,在142~192、238~288、874~924、1359~1409 base处可能存在启动子,存在253个潜在的转录因子结合位点;比较发现,ZF5F/ZF5.01和HAND/HAND2_E12.01是鹿茸IGF-1区别于牛、羊、人、猪、家鼠、斑马鱼IGF-1启动子区域的潜在转录因子,这些潜在转录因子与鹿茸生长的关系尚待进一步试验证实;综合分析表明CCS1 074<1~1580base为鹿茸IGF-1 5′端区域,1581~1966 base为外显子1,1903~1966 base为信号肽,1967~>2087 base为内含子1。     

蒙古绵羊Bcl-2基因5′端cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊bcl-2基因5′端,根据Gen Bank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出bcl-2的c DNA,并重组到p Blueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,测出5′RACE产物434个核苷酸序列,该序列包括C端144个氨基酸编码序列、翻译起始密码子ATG。     

牦牛FSHB基因的克隆及生物信息学分析

通过PCR技术以及生物信息学软件,对牦牛FSHB基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明:牦牛FSHB基因的c DNA序列区长645 bp,编码的氨基酸129个;同源性和分子进化树分析结果显示,其CDS区碱基序列与普通牛的关系最近,然后依次是水牛、山羊、绵羊、梅花鹿、马、人和小家鼠。牦牛FSHB蛋白的分子量14683,分子式C637H978N170O193S18,等电点6.27,总原子数1996,半衰期估计30 h,不稳定指数45.8,脂肪指数61.9;该蛋白属于非跨膜蛋白,α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲分别为30、29、6和64个,所占的比例分别为23.26%、22.48%、4.65%和49.61%。该基因编码的氨基酸在第18位点和第19位点可能存在信号肽。该研究探明牦牛FSHB基因与其他种属的差异,为进一步研究牦牛FSHB基因结构、功能及其与繁殖功能的关系提供了理论基础。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因5′端部分片段克隆及序列分析

本研究扩增出猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) TH- 98株 S基因 5′端 6 72 bp片段 (TS1) ,包括 B、C两个主要抗原位点。将该片段克隆到 p MD 18- T载体上 ,经鉴定 TS1片段正确插入 p MD 18- T载体上。序列测定和分析表明 ,该片段的核酸序列与国外 TGEV毒株 Miller,Purdue15 ,FS772 /70等有很高的同源性 ,达 96 .88%以上 ,氨基酸同源性为 95 .0 9%以上 ,抗原位点 C(S蛋白第 4 8位氨基酸 )的丝氨酸变为脯氨酸。本研究首次克隆国内分离株 TH- 98株 S基因含有抗原位点 B、C且在 PRCV中缺失的片段。为进一步揭示 TGEV强弱毒株差别的分子机制和分子诊断的研究奠定了重要基础。     

牛GDF9基因5′侧翼区克隆及生物信息学分析

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用。本研究克隆了牛GDF9基因5′侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5′侧翼区没有CpG岛;利用Promoter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件,如1个TATA-box、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域。     

牛FSHR基因5′端侧翼序列的分析和多态性研究

以中国西门塔尔牛基因组DNA为模板，参照绵羊的FSHR基因序列设计和合成引物、PCR扩增获得长度为931bp，包括5′端侧翼797bp和结构基因第一外显子区134bp的牛FSHR基因片段，将该片段克隆于PUC18载体中，作序列分析发现：牛的FSHR基因转录启动子的遗传结构与人和鼠的FSHR基因不同，它的基因转录启动区含有TATA盒和类CAAT盒序列。在检索出的转录调节元件、或特征性序列位点，牛与绵羊在5个序列位点有碱基变异，这可能与牛和绵羊的产仔率高低不同相关，对34头份中国西门塔尔牛的扩增产物，应用PCR－RFLP方法进行多态性分析，TaqⅠ酶切出现了多态性，酶切产物电泳呈现3种基因型，由2种等位基因构成，通过对基因频率和基因型频率在种用公牛，双胎母牛和随机牛类群中分布的比较研究结果，认为该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。     

牦牛Toll样受体5基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布牛Toll样受体5（toll-like receptors 5,TLR5）基因序列,设计全长引物,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析结果表明,克隆得到牦牛TLR5基因全长2582 bp,开放阅读框2577 bp,编码氨基酸858个,N端含有21个氨基酸组成的信号肽,分子质量为97.981 ku,理论等电点为4.85;蛋白预测结果表明,TLR5编码蛋白整体表现为亲水性;同源性分析结果表明,牦牛与野牦牛、黄牛、绵羊、山羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,说明TLR5基因序列具有较高的保守性。牦牛TLR5基因序列的成功克隆为今后深入研究牦牛及高原动物抗病及免疫机制提供非常重要的理论基础。     

牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息学分析

本研究以牦牛的角蛋白关联蛋白3.3(KAP3.3)基因作为研究对象,通过查询GenBank中收录的黄牛KAP3.3基因的mRNA序列设计1对特异性引物,通过逆PCR、PCR以及基因克隆测序的方法首次获得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:牦牛KAP3.3基因的CDS区为297 bp,编码98个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白。二级结构含有延伸链、β转角以及无规卷曲3种。氨基酸序列与黄牛的完全一致,具有Keratin,high sulphur matrix protein家族的完整结构域。     

马鹿茸IGF-1基因5''端克隆及生物信息学分析

对鹿茸IGF-15’端调控序列进行生物信息学分析。提取鲜马鹿茸顶部组织基因组DNA，设计简并引物，利用PCR获得马鹿茸IGF-15’端调控序列及部分外显子（命名为CCS1074），用DNAMAN软件进行CCS1074与其他种属IGF-1基因的序列同源性分析；使用在线分析程序预测CCS1074的潜在转录因子结合位点并比较分析鹿茸区别于其他种属IGF-1的特有潜在转录因子，进行TATAbox、CpG岛、候选启动子区段及信号肽预测。结果获得了包含部分外显子的鹿茸IGF-1基因5’端（Genbank Accession No．DQ234266）；序列同源性分析表明鹿茸IGF-1与牛、羊IGF-1基因5’端存在差异；生物信息学分析表明：在CCS1074180～310base处存在CpG岛，在142～192、238—288、874～924、1359～1409base处可能存在启动子，存在253个潜在的转录因子结合位点；比较发现，ZF5F／ZF5．01和HAND／HAND2-E12．01是鹿茸IGF-1区别于牛、羊、人、猪、家鼠、斑马鱼IGF-1启动子区域的潜在转录因子，这些潜在转录因子与鹿茸生长的关系尚待进一步试验证实；综合分析表明CCS1074〈1～1580base为鹿茸IGF-15’端区域，1581—1966base为外显子1，1903—1966base为信号肽，1967～〉2087base为内含子1。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P<0.05;P<0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P<0.05;P<0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物,以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板,应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列,并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明,PCR扩增获得的片断为1643bp,三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比,同源性分别为97.49%和97.41%,分别在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比,同源性为99.60%,且3个位点有碱基突变,其中 1184和 1365位点突变引起氨基酸密码改变。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物，以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板，应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列，并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明，PCR扩增获得的片断为1643bp，三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比，同源性分别为97．49％和97．41％，分剐在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比，同源性为99．60％，且3个位点有碱基突变，其中＋1184和＋1365住点突变引起氨基酸密码改变。     

麦洼牦牛SRY基因克隆及序列分析

SRY是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段,是多数哺乳动物性别决定基因之一。本试验采用克隆测序SRY基因并结合生物信息学对其序列进行分析,利用软件Codon W分析麦洼牦牛、普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡和人该基因编码区的密码子偏好性。克隆测序得到SRY基因序列含1个690 bp的开放阅读框,共编码229个氨基酸;其编码区核苷酸序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99.9%、93.9%、91.2%、76.5%、43.3%、21.4%、69.1%。经聚类分析,麦洼牦牛首先与普通牛聚在一起,绵羊与山羊聚为一类,这两类相聚后再依次与猪、人、小鼠相聚,最后与鸡聚为一类,其结果与以往的生物学分类结果一致。该基因编码的蛋白质分子式为C₁₁₅₅H₁₈₂₇N₃₅₁O₃₄₈S₁₁,相对分子质量为2655.0,理论等电点PI为9.55,亲水性平均数为-0.855。其密码子偏好性分析显示,T3_s为0.2905、C3_s为0.3240、A3_s为0.3728、G3_s为0.2963,第3位碱基中出现G和C占第3位碱基总量的48%,同义密码子数为61。上述数据表明麦洼牦牛SRY基因编码序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人具有较高的一致性,在物种进化过程中较为保守。该基因对含A的密码子有较高的偏爱性,尽量避开以G结尾的密码子,且其所编码的蛋白质为亲水性蛋白。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

牦牛EPOR基因编码区序列的克隆及分析

以处于不同海拔高度的3个牦牛品种即巴州牦牛、大通牦牛、九龙牦牛为研究对象,对各牦牛品种的促红细胞生成素受体(EPOR)基因编码区进行PCR扩增和克隆测序.在对测序结果进行拼接得到牦牛EPOR基因编码区全序列基础上,利用生物信息学软件对其序列进行生物信息学及比较基因组学分析.结果表明:牦牛的EPOR基因编码区全长1 527 bp,编码508个氨基酸;EPOR信号肽由25个氨基酸组成,胞外域由225个氨基酸组成,跨膜区由22个氨基酸组成,胞浆域由236个氨基酸组成;EPOR基因编码区在牦牛品种间及其与普通牛间均存在一定的差异,这些差异是否与牦牛的适应性有关,值得进一步研究.     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

大通牦牛DQA2基因CDS区序列分析

为了获得大通牦牛DQA2基因序列,并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,通过DNAstar软件和在线服务器预测大通牦牛DQA2基因CDS区编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、糖基化位点、信号肽、跨膜结构、二级结构以及三级结构。结果表明,大通牦牛DQA2基因CDS区长度为765bp,编码253个氨基酸。蛋白结构预测结果表明,该蛋白是一种混合型的可溶性蛋白质,具有4个潜在的N-糖基化位点,分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369;在第1~23位氨基酸之间存在信号肽;存在1个典型的跨膜螺旋区,氨基酸序号为216-239;蛋白质功能显示该蛋白存在信号受体活性、催化活性、运载体、调节代谢过程、细胞定位及免疫系统过程的功能。本研究结果为进一步研究大通牦牛的遗传育种提供理论基础。     

牦牛生长分化因子-9基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中普通牛生长分化因子9(GDF-9)基因序列(AF 307092)设计1对引物,以麦洼牦牛卵母细胞总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛GDF-9基因cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:所克隆的1399 bp片段为预期的牦牛GDF-9基因cDNA序列,包含由2个外显子组成的全编码区和3′-下游部分序列.牦牛GDF-9基因编码区核苷酸序列长度为1362 bp,编码453个氨基酸,与GenBank中报道的普通牛、水牛、绵羊、山羊相应序列一致,而与人和黑猩猩存在差异.和普通牛相比,牦牛GDF-9基因编码区存在1处碱基转换(C→T),导致相应的氨基酸由丙氨酸(A)转换为缬氨酸(V).牦牛与普通牛、水牛、绵羊、山羊、人和黑猩猩的核苷酸同源性分别为99.9%、98.4%、97.0%、96.8%、85.6%和85.1%;氨基酸同源性分别为99.8%、97.1%、95.1%、95.4%、79.4%和79.5%.利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树结果基本一致,即牦牛与普通牛先聚为一类,再与水牛聚为一类,而后与绵羊和山羊聚为一类,最后与人和黑猩猩聚为一类.该聚类结果与物种间遗传距离大小一致,也与各物种在动物学上的分类相吻合,表明GDF-9基因编码区适用于构建物种间系统进化树.