坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。     

坛紫菜叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据日本kazusaDNA研究所收录的坛紫菜EST序列AV434021和AV433683设计引物,对坛紫菜配子体的RNA进行RT-PCR扩增,得到产物长度为480 bp。利用DNAstar、Clastal1.81等专业软件进行分析,结果表明,所得产物为紫菜叶绿体的psaA基因片段,其G C含量为55.9%。G C含量明显高于A T的含量;对按核酸序列推导的蛋白序列进行二级结构和三级结构预测,该蛋白存在3个α螺旋和2个β折叠。     

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用=Application of ISSR markers in germplasm identification of different color’s Porphyra haitanensis filament strains［刊,中］/谢潮添（集美大学水产学院,厦门361021）,纪德华,陈昌生,徐燕,张元//水产学报,—2007,31(1).-105～111 用ISSR分子标记技术对4个不同色泽坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状体品系（分别为桔黄色,褐绿色,棕红色和紫色）及1个野生型对照丝状体品系（褐红色）进行了遗传分析,共筛选出11条引物,PCR反应得到了129个扩增位点,多态位点比率达88.4％,有效等位基因数为1.6369,期望杂合度为0.3609,Shannon多样性指数为0.5265;根据Nei方法计算了这5个坛紫菜丝状体品系间的遗传相似性系数和遗传距离,结果发现4个不同色泽丝状体间的平均遗传距离为0.5727,它们同野生型对照的平均遗传距离为0.6564,同时应用UPMGA法对它们进行了聚类分析。最后应用引物812扩增的4个多态性位点构建了这5个不同坛紫菜丝状体的DNA指纹图谱,使每一品系都具有独特的DNA指纹,并将其转化成了计算机可以识别的数码指纹,可以方便地应用于坛紫菜丝状体的种质鉴定中。结果表明ISSR分子标记技术可以作为坛紫菜丝状体种质鉴定的有效技术手段,提供快捷、准确的鉴定结果。图3表5参24 关键词：坛紫菜; ISSR标记; 遗传分析; 种质鉴定 E-mail: cschen@jmu.edu.cn     

坛紫菜种质材料DNA指纹图谱的构建

采用20对简单重复序列(SSR)引物对福建省坛紫菜种质资源库中保存的44个坛紫菜种质材料进行了遗传分析,共检测到了81个多态性位点,每对引物检测到的等位基因介于2~6个之间,平均为4.05个,引物的PIC值介于0.15~0.79之间,平均为0.57。然后根据3对引物(Phes08,Phes03和PC13)扩增出的16个多态性位点构建了44个坛紫菜种质材料的指纹图谱库,使得每一种质材料均具有其特异的DNA指纹图谱。并根据指纹图谱中各扩增位点条带的有无,将指纹图谱转化成了计算机可以识别的数码指纹,开发了相应的数码指纹识别软件,为坛紫菜种质的自动化鉴定及坛紫菜种质资源库的信息化管理奠定了基础。     

坛紫菜种质品系表型性状的变异规律分析

坛紫菜(Pyropia haitanensis)的表型性状是遗传育种的主要考察指标。研究以福建省坛紫菜种质资源库保存的73份种质品系为实验材料,对藻体的5个形态特征和14个数量性状数据进行了统计分析,以探讨坛紫菜表型性状的遗传变异规律。结果表明,坛紫菜藻体的形状、颜色、锯齿大小和扭曲程度4个形态特征与藻体长度、宽度、重量和厚度4个数量性状极显著相关(P0.01),叶片基部形状与藻体长度、宽度、鲜重和厚度显著相关(P0.05);比较不同性状均值发现,线形藻体的平均长度增长速度最快,基部为心脏形的藻体平均重量增长速度最快,无锯齿的藻体厚度最薄。巢式方差分析结果显示,坛紫菜品系间的遗传变异(72.79%)远大于品系内(21.46%),说明品系间的变异是坛紫菜表型变异的主要来源。坛紫菜藻体各表型性状的变异系数为7.14%~35.99%,其中藻体厚度变异系数最低,而单株藻体重量的变异系数最高,说明藻体厚度的选择潜力相对较小,而重量的选择潜力则较大。这些数据为后续坛紫菜的遗传育种提供了基本资料。     

坛紫菜杂交重组品系的选育与特性分析

坛紫菜选育品系(HR-6)具有叶状体快速生长期的前期生长较快,色素蛋白含量高,但成熟较早,生长期短,丝状体的壳孢子放散量较少等特性;坛紫菜另一个选育品系(HR-5)具有叶状体快速生长期的前期生长较慢,色素蛋白含量高,但成熟晚,生长期较长,丝状体的壳孢子放散量多等特性。为改善HR-6品系叶状体成熟较早,壳孢子放散量较少的弱点,本文以HR-6品系为父本,HR-5品系为母本进行种内杂交,从杂合丝状体产生的F1叶状体中选育出了综合性状更加优良的品系(WD-7)。在叶状体的快速生长前期(日龄30~45d),父本品系的绝对生长率为6.68cm/d,母本品系为3.63cm/d, WD-7品系为6.67cm/d;在叶状体的快速生长中后期(日龄46~60d),父本品系的绝对生长率降至5.15cm/d,母本品系则升至7.27cm/d,而WD-7品系高达11.54cm/d。父本品系的叶状体成熟最早,培养35d左右,大部分个体已成熟;WD-7品系遗传了母本品系成熟较晚的优点,日龄55d之后,大部分个体才出现成熟。日龄35d的叶状体平均厚度,WD-7品系为29.87μm,分别比父、母本品系增加了10%和16%,藻体的韧性明显增强。WD-7品系的壳孢子放散总量为183.42万个/壳,分别是父、母本品系的1.17倍和0.57倍。上述结果证实,WD-7品系不仅遗传了父本品系叶状体快速生长期的前期生长较快的特性,同时又遗传了母本品系叶状体成熟晚、生长期长、中后期生长快的优点,壳孢子放散量也比父本品系有所增加,此品系有望被培育成适宜大规模栽培的新品种。     

微卫星标记在坛紫菜丝状体品系DNA指纹构建中的应用

用从条斑紫菜EST数据库中筛选合成的微卫星引物对8个坛紫菜丝状体品系进行微卫星DNA指纹扩增。5个微卫星引物共扩增出32条带,其中3对引物所扩增出的5个条带(AU192094—127、AU187410—335、AU187410—190、AU194267—203和AU194267—328)被用来构建8个坛紫菜丝状体品系的DNA指纹。在这个图谱中,每个丝状体品系都有独一的指纹模式,彼此很容易被区分开。所获得的DNA指纹图谱,可用来进行孟德尔分离研究,及为坛紫菜纯系鉴定提供分子基础。     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

坛紫菜两个世代差异的分析及在生产中的应用

坛紫菜是我国特有的栽培品种,主要养殖于福建、浙江和广东等地,其产量约占全国紫菜产量的75%。坛紫菜的生活史包括二倍孢子体和单倍配子体两个异型世代,二者在藻体形态、细胞结构、生化组成、生理特性等方面存在显著差异。分析不同世代基因的表达差异,     

坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

高温胁迫下坛紫菜叶状体的生理响应

以坛紫菜耐高温品系Z-61 F₄代叶状体为试验材料、野生型坛紫菜叶状体为对照,研究了高温胁迫(30 ℃、26 ℃)与正常培养温度(21 ℃)下,处理不同天数(0、2、4、6、8、10 d)后坛紫菜叶状体中自由基含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和游离脯氨酸(Pro)含量的动态变化过程。结果发现耐高温型坛紫菜对高温胁迫的生理响应过程:高温胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损,产生过量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应,清除活性氧→自由基含量下降。同时比较两种紫菜对高温胁迫的生理响应过程,发现耐高温型坛紫菜在高温胁迫下能同时启动抗氧化系统和渗透压调节系统,而野生型坛紫菜则只能启动渗透压调节系统,并且两种紫菜抗氧化系统的本底含量也存在着显著差别。由此说明不同品系坛紫菜耐高温性状差异的可能原因是细胞内抗氧化系统的应激性和本底含量存在差异。     

低氮、磷胁迫对坛紫菜叶状体生理生化特征的影响

以坛紫菜耐低氮(N)、磷(P)品系9号Ⅳ叶状体为材料,研究了低N、P胁迫不同时间水平对坛紫菜品质及自由基含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和游离脯氨酸(Pro)含量等生理指标的影响。结果表明,在低N、P胁迫条件下,作为坛紫菜品质重要指标的光合色素、粗蛋白和游离氨基酸含量均显著下降,而其余各项生理指标均随胁迫时间增加表现为动态变化的过程,由此推测耐低N、P型坛紫菜叶状体应答低N、P胁迫的生理过程为:低N、P胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损,产生大量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应,清除活性氧→自由基含量下降。该实验结果为全面了解坛紫菜应答低N、P胁迫的生理机制奠定了基础,同时也为后续坛紫菜抗逆新品种的选育提供了理论指导。     

坛紫菜自由丝状体响应琼胶寡糖的激发

为了研究琼胶寡糖对坛紫菜自由丝状体藻丝生长和壳孢子囊枝形成的激发的影响,实验采用琼胶寡糖激发坛紫菜自由丝状体,以液相氧电极检测坛紫菜丝状体净光合放氧速率的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜丝状体的H_2O_2释放量;利用LC-MS检测红藻糖苷含量变化;利用实时定量PCR技术检测坛紫菜丝状体H_2O_2产生相关基因(Phrboh、Ph SOD)和红藻糖苷合成相关基因(Phnho1、Phgpdh、Phtps)的表达情况;并利用显微镜观察法检测壳孢子囊枝数量的变化。结果发现,琼胶寡糖能够激发坛紫菜自由丝状体的系列响应,表现在净光合放氧速率以及光合同化产物红藻糖苷的含量和生物合成出现增加;H_2O_2释放量持续增加,与产生H_2O_2相关的2个酶基因Phrboh和Ph SOD的表达增强。此外,琼胶寡糖也能够促进在坛紫菜自由丝状体的发育,在培养第30天时,琼胶寡糖处理组的壳孢子囊枝形成率达到59%,显著高于对照组46%。综上所述,琼胶寡糖能够增加坛紫菜自由丝状体的光合速率和光合同化产物,并通过形成H_2O_2的酶的表达来诱导活性氧的释放;琼胶寡糖还能促进坛紫菜自由丝状体的繁殖发育。     

坛紫菜优良品系“申福2号”的特性分析与海区中试

以人工选育的坛紫菜优良品种“申福1号”( SF-1)、优良品系“申福2号”(SF-2)和野生型品系(WT)为材料,通过室内培养与海区中试,对SF-2的优良特性和生产适用性进行评估.结果发现,与WT相比,SF-2的叶状体在生长速率、藻胆蛋白含量、藻体厚度及产量上均存在十分显著的优势.在相同的室内培养条件下,SF-2叶状体的绝对生长速率显著高于WT,培养至90d时,其平均长度为(391.6 ±47.37) cm,是WT的10倍.3个品系(种)的叶状体活体吸收光谱在350～750 nm范围内均存在5个明显的吸收峰,SF-1与SF-2之间的各峰值差别较小,但均明显高于WT.SF-2叶状体的藻胆蛋白(PE+PC)含量为(90.81±3.98) mg/g,是WT的1.95倍左右,比SF-1的含量稍高.SF-2叶状体的平均厚度为(31.95±4.16) μm,分别比WT与SF-1薄38.7％和14.0％.SF-2的壳孢子放散量约为28.6万个/壳,比SF-1提高了43.0％,可以满足生产采苗需求.海区栽培的前四水鲜菜重量,SF-2为24 000 kg/hm2,比WT和SF-1分别增加30.1％和6.7％.上述结果证实,SF-2的海区壳孢子放散量可以达到生产要求,叶状体的生长速率、生长期、产量和品质比WT均明显提高,生长优势十分明显.所以,该品系有望在生产上进行大规模栽培.     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜叶状体的抗生素联合除菌效果

为研究坛紫菜及其外生菌群对氯霉素、竹桃霉素和头孢噻肟3种抗生素的敏感性,通过将其与氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素的组合,优化坛紫菜叶状体的除菌方法,并利用涂布平板、qRT-PCR及16S rRNA测序分析其除菌效果。结果显示,当坛紫菜先以氨苄青霉素(300 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)和庆大霉素(100 mg/L)混合处理18 h,再以氯霉素(50 mg/L)、头孢噻肟(200 mg/L)和竹桃霉素(50 mg/L)混合处理4 d,叶状体的健康率保持在96.3%以上,而对可培养细菌的抑制率达到99.9%。根据qRT-PCR和16S rRNA的结果可知,该种组合方法较前3种抗生素的组合,其菌总数下降41.5%,微生物的丰度和多样性指数明显下降。其中,假单胞菌、交替赤杆菌、交替单胞菌以及海杆菌等得到针对性的抑制。研究表明,多种抗生素的优化组合能够对坛紫菜叶片的菌群结构产生显著影响,使其受到抑制,但仍无法达到绝对除菌的效果。