乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因载体的构建及其克隆策略

6条长约80bp的寡聚核苷酸链，通过其互补末端延伸补平成3条双链DNA；3条双链DNA按3：1：3混合，PCR扩增得到大量拟蛛丝蛋白基因单体；将单体多聚化，加上设计好的信号肽和终止密码子，再将多聚体基因构建到乳腺高效表达载体pBC1上，使之成为乳腺高效表达的拟蛛丝蛋白基因载体。着重讨论了基因构建过程中DNA克隆技巧和策略。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

木质素合成关键酶基因CCR的克隆及其反义表达载体的构建

木质素是植物体中总量仅次于纤维素的第二大有机物质，占次生物质总量的95％以上，在植物体具有一定的生理功能。但由于木质素含量过高使造纸工业中污染增加、饲草消化吸收率降低，因此木质素含量基因调控已成为植物基因工程研究的一个重要方向。羟基肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase，CCR)可还原3种羟基肉桂酸的     

小鼠肾组织中EGF基因的克隆及其植物表达载体的构建

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，在临床上具有重要的应用价值。由于天然EGF来源有限，用基因工程方法生产EGF蛋白已成为一个重要的替代途径。本研究用RT—PCR法从小鼠的肾组织中克隆了EGF基因，并构建到植物表达载体上，为EGF基因在高等植物细胞中的表达奠定基础。     

克氏杆菌gldA基因亚克隆及其原核表达载体构建

甘油脱水酶(glycerol dehydratase EC 4．2．1．30)是控制甘油分解和产生1，3-丙二醇的关键性限速酶。甘油脱水酶是由α、β和γ3个亚基组成的复合物(α2β2γ2)，分别由gldA、gldB和gldC基因编码。研究(Frank et al.1998;Macis et al.,1998;Markus et al.,1996)认为甘油脱水酶α亚基无论在甘油脱水酶的结构上还是功能上都起到重要的作用。本研究克隆了克氏杆菌的甘油脱水酶α亚基基因(gldA)并构建了该基因的原核表达载体，为甘油脱水酶基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

酿酒酵母耐铜基因CUP1的克隆及其植物表达载体的构建

酿酒酵母铜金属硫蛋白（ｃｏｐｐｅｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,Ｃｕ－ＭＴ）,属于第Ⅱ型金属硫蛋白,Ｃｕ－ＭＴ由酿酒酵母耐铜基因ＣＵＰ１编码,由６１个氨基酸残基组成,其中半胱氨酸残基１３个,占Ｃｕ－ＭＴ总氨基酸数的２１．３％,Ｃｕ－ＭＴ与铜离子有较强的结合力,在酵母细胞中主要参与过量铜的解毒作用。本研究通过ＰＣＲ方法,从酵母基因组ＤＮＡ中扩增出了ＣＵＰ１基因,克隆于ｐＵＣ１９的多克隆拉点。扩增     

TES基因C端的分段克隆与表达

为了在大肠杆菌中分段表达人类TES基因C端3个顺次排列的LIM结构域,利用PCR技术从含有TES基因全长编码序列的质粒pCMV-HA-TES中扩增出这3个LIM domain基因片段,分别重组入pGEM-T载体,再经酶切后,将获得的目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1进行融合表达。酶切鉴定及测序结果表明,扩增产物与已知基因序列一致,成功构建了3个目的片段的pQE-N1表达质粒;SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达出与预期分子质量大小相同的3个融合蛋白。     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

雪花莲外源凝集素基因的克隆,序列分析和植物表达载体的构建

雪化莲外源凝集素对同翅目害虫有强烈的抑制作用，本研究从雪花莲叶片中分离出总ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＴ方法扩增出了雪花莲外源凝集素基因，并将其克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）的ＥｃｏＲ Ｖ位点。     

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析

SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系。本文以抑制差减杂交（sup—pression subtractive hybridization．SSH）技术获得SUMO的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆,获得了全长为396bp的SUMO基因编码区cDNA全长,我们将该基因命名为GhSUMO,推测该基因编码95个氨基酸。分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板,对该基因进行了PCR扩增验证,测序结果表明,GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致,且没有内含子。蛋白序列分析表明,该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂／连接位点,以及保守的疏水表面和Ulpl—Smt3互作位点。系统进化分析表明,该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性,与其它双子叶植物同源序列次之,而与单子叶植物的相似性较低。棉苗接菌后实时定量PCR结果显示,该基因表达量在接黄萎病菌的量48h后明显上调,96h达到未接菌对照的5倍以上。GhsSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达,表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用。     

生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫*

为构建高免疫原性的生长抑素（somatostatin，SS）DNA疫苗，将SS基因插入到pcS／SS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间，构建含2拷贝SS的融合表达质粒pcS／2SS。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pcS／2SS构建成功。脂质体包裹法将pcS／2SS转染HeLa细胞，ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。结果表明，融合目的基因在HeLa细胞获得表达，S／2SS融合蛋白具有比S／SS融合蛋白更强的SS抗原抗体反应性。将pcS／2SS免疫6只大鼠后，2／3的大鼠产生了抗SS抗体，结果证明，所构建的质粒pcS／2SS可以表达生长抑素，表达产物具有免疫原性。     

甘肃红豆草BAN基因克隆与双标记选择表达载体构建

为探讨编码花青素还原酶BAN基因的功能及其与缩合单宁合成的关系,根据BAN基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术获得甘肃红豆草BAN的相似基因;利用生物信息学相关软件分析,预测其c DNA序列编码的蛋白质结构和功能;采用Real-time PCR法检测该基因在甘肃红豆草各组织中的表达;构建含有BAN基因的双标记选择载体。结果表明,克隆的BAN基因与报道的BAN基因序列相似性达到99.41%,其ORF长为1 020 bp,可编码339个氨基酸残基,具有花青素还原酶保守结构域和重要功能位点;三级结构预测显示,预测模型与花青素还原酶单体结构(C2RH8A)相似,属于短链脱氢/还原酶超家族成员,表明其可能具有花青素还原酶的功能。BAN基因在各组织中均表达,其表达量依次为荚果、叶、蕾、花、茎。以此为靶序列,构建携带抗除草剂bar和绿色荧光蛋白GFP基因的双标记选择植物表达载体,将为缩合单宁合成、代谢的进一步研究及抗除草剂和抗臌胀病牧草新品种的培育奠定基础。     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因，它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量。本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增，在原Sac I酶切位点后添加了新的Sac I酶切位点，利用组织化学染色法检测，结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达，终止子功能正常，载体改造成功。用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBI121N-Lc，利用农杆菌介导法转化菊花叶盘，获得了19株生根抗性苗。通过提取抗性苗基因组总DNA，PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系，PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中。同时，在己获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象。     

玉米颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS )基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

根据已发表的玉米颗粒结合型淀粉合成酶GBSS（granule-bound starch synthase）基因序列,设计两对引物,其中一对为定点突变的过度引物。从授粉后15d的玉米胚乳中提取总RNA,以反转录合成的cDNA第一链为模板,首次用定点突变、RT-PCR、融合PCR的方法克隆了GBSS 基因的全长cDNA（1818bp）片段。序列测定表明,该片段与文献报道的序列具有99.72％的同源性。并构建了以胚乳特异表达性的Gt1为启动子,以NOS-ter为终止子的植物表达载体pBI-Gt1-GBSS,其含有NPT‖选择标记基因。以期实现特定时期GBSS基因在玉米胚乳中的大量表达。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。