牛筋草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以牛筋草地上组织为材料,采用正交优化和单因子试验两种方法对影响牛筋草ISSR-PCR体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度5个因素进行优化试验,建立适合牛筋草ISSR-PCR的反应体系.结果表明,牛筋草ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:Mg2+1.75 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U/25 μL,引物0.3μmol/L,模板DNA 80 ng/25μL,10×PCR Buffer 2.5 μL/25 μL.利用优化体系进行牛筋草的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果.     

白背飞虱RAPD-PCR反应体系的正交设计优化

白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)是水稻重要害虫之一。研究采用L16(45)正交设计优化试验,构建了白背飞虱RAPD最优反应体系,并对引物退火温度和反应循环次数进行了优化。结果表明:白背飞虱RAPDPCR最优反应体系为2μL 10×PCR Buffer(10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl),2.4 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTPs,0.7μmol/L引物,0.8U Taq DNA Polymerase和30 ng模板DNA,ddH2O补充至20μL。本研究采用的10条引物的最佳退火温度在35-39℃间,以引物相应最优退火温度和40次PCR反应循环可获得较好的白背飞虱RAPD-PCR结果。     

美国白蛾基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

用改进的SDS法从无水乙醇浸泡美国白蛾幼虫标本中提取到高分子量的可用于RAPD扩增的基因组DNA。用正交试验对影响RAPD扩增的条件进行优化得到最佳反应体系：20 μL反应体系中,模板浓度1.25 ng/μL、引物浓度1.2 ng/μL、dNTP浓度 0.2 mmol/L、Mg2+浓度 3.0 mmol/L、TaqDNA聚合酶用量2.5 U。确定最佳退火温度为38 ℃。PCR反应条件：94 ℃ 30 s、38 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s 35个循环后,72 ℃延伸5 min。为在分子水平上讨论美国白蛾种群的遗传分化提供基础。     

三重PCR检测茄子青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌

为快速、准确对田间茄子发病植株和土壤中3种土传病害的病原菌青枯病菌Ralstonia solanacearum、黄萎病菌Verticillium dahliae和白绢病菌Sclerotium rolfsii进行检测,筛选这3种病菌的特异性引物,建立这3种病菌的三重PCR检测体系,对其退火温度、引物浓度、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶进行优化,对优化后体系的特异性和灵敏度进行检测,并利用优化体系对田间采集的病害样品和土壤样品进行检测。结果表明,在优化后的50μL三重PCR检测体系中,RS-1-F/RS-3-R、dllz1/dllz2和SRITSF/SRITSR引物的最佳浓度分别为0.16、0.16和0.28μmol/L,10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶体积分别为6、5和1μL,检测体系的最佳退火温度为54℃。按照优化后的反应条件能分别扩增出青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌3种病菌的特异条带,分别为716、350和500 bp,其他对照病菌无条带。该体系对病菌DNA检测灵敏度达到0.1 ng/μL。该...     

腐食酪螨ISSR最佳反应体系的设计

本文以腐食酪螨基因组DNA为模板,采用逐个参数优化法,探讨腐食酪螨ISSR实验的最佳反应体系。实验结果表明,腐食酪螨ISSR-PCR最佳反应体系:总体积25μL,其中Mg2+1.5 mM;10×Buffer 2.5 mM;dNTPs 0.2 mM;ISSR引物0.2μM;模板DNA 50 ng;Taq DNA聚合酶0.75 U。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1 min,(48℃、50℃、52℃)复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环35次,结束后72℃延伸5 min,4℃保存。同时通过梯度退火实验,确定不同引物的最佳退火温度。     

高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化

通过添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施,建立并优化了PCR扩增体系,成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2 434 bp且GC含量高达70.9%的aac基因。PCR反应体系为20 μL包括5%DMSO、2.5 mmol/L MgCl2、500 μmol/L dNTP、10 pmol/L引物、1.25 U Taq酶、50 ng模板DNA。首先采用热启动PCR：95 ℃5 min,保持80 ℃,加入Taq酶;然后采用二步PCR：5个循环包括变性95 ℃1 min,65 ℃1 min;最后采用降落PCR：30个循环为95 ℃1 min,78 ℃1 min,每个循环降低0.5 ℃,72 ℃3 min;补充10个循环为95 ℃ 1 min,63 ℃1 min,72 ℃3 min;72 ℃10 min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。     

小菜蛾ISSR-PCR反应体系的建立与正交设计优化

以小菜蛾(Plutella xylostella)基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计方法,建立小菜蛾的ISSR最佳反应体系。通过梯度退火试验,确定不同引物的最适退火温度。优化得到的反应体系(20μL)为:Mg2+浓度1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶2.5U、dNTPs浓度0.2mmol/L、引物浓度1.25μmol/L、模板DNA量20ng。反应程序为:94℃预变性5.0min;94℃变性45.0s,40～61℃(不同引物退火温度各异)退火1.0min,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10.0min;10℃保存。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,获得了清晰、重复性好的DNA谱带。     

高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化

通过添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施,建立并优化了PCR扩增体系,成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2434bp且GC含量高达70．9Y00的aac基因。PCR反应体系为20pL包括5％DMSO、2．5mmol／LMgCl2、500／xmol／L dNTP、10pmol／L引物、1．25U Taq酶、50ng模板DNA。首先采用热启动PCR：95℃5min,保持80℃,加入Taq酶;然后采用二步PCR：5个循环包括变性95℃1min,65℃1min;最后采用降落PCR：30个循环为95℃ 1min,78℃1min,每个循环降低0．5℃,72℃3min;补充10个循环为95℃1min,63℃1min,72℃3min;72℃10min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。     

南方、花生和爪哇根结线虫PCR检测方法

为快速、准确、稳定的鉴定南方、花生和爪哇根结线虫,利用已报道的南方和爪哇根结线虫的两对特异性引物,结合本研究设计的花生根结线虫特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了3种根结线虫的PCR检测方法。结果表明,该方法能够特异性扩增以上3种根结线虫,特征片段长度分别为399、335和670 bp,灵敏度达到单条2龄幼虫的水平。研究结果将为以上3种根结线虫的快速鉴定提供技术支持。     

采用环介导等温扩增法(LAMP)快速检测苹果根结线虫

为高效、简便、快速地对我国进境植物检疫性有害生物名录中的非中国种—苹果根结线虫Meloidogyne mali进行检疫,通过比较Gen Bank中根结线虫相关序列,以苹果根结线虫28S r DNA非保守区域序列设计环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,并优化反应条件,建立一种可快速检测苹果根结线虫的LAMP检测体系。结果显示:d NTPs浓度为0.4 mmol/L、Mg~(2+)浓度为5.0 mmol/L、不添加甜菜碱、反应时间为60 min时,LAMP检测体系扩增效率最高;用琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green I染色和LFD试纸均能检测到苹果根结线虫的扩增产物。所建立的LAMP检测体系能够从10种供试植物线虫种群中特异性地检测出苹果根结线虫,灵敏度为1/20 000条线虫DNA,比常规PCR灵敏度高10倍。表明所建立的苹果根结线虫LAMP快速检测体系可用于我国口岸进境植物中苹果根结线虫检疫。