金黄色葡萄球菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞PDGF-BB mRNA及蛋白表达的影响

为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)中PDGF-BB m RNA及蛋白表达的影响,本研究采用热灭活的不同浓度的S.aureus菌液(0、105、106、108cfu/m L)作用于BMEC,分别在不同时间点(6 h、12 h、24 h、48 h)利用荧光定量PCR和western blot方法检测PDGF-BB m RNA及其蛋白的相对表达量。结果显示,不同浓度菌液处理组的PDGF-BB m RNA相对表达量随着作用时间延长表达量升高(p0.05)。6 h处理组随着菌液浓度的升高,PDGF-BB m RNA的相对表达量呈升高趋势;12 h处理组随着菌液浓度的升高,PDGF-BB m RNA的相对表达量呈降低趋势;24 h和48 h处理组105cfu/m L菌液处理组PDGF-BB m RNA相对表达量最高(p0.05)。同时,各时间点不同浓度菌液处理组PDGF-BB蛋白的相对表达量和m RNA表达基本一致。本研究表明,热灭活的S.aureus能够促进BMEC PDGF-BB m RNA和蛋白的表达。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及蛋白含量测定

为建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系(BMEC),进一步研究乳腺上皮细胞体外蛋白的分泌情况,本试验首先采用组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,用胰蛋白酶纯化细胞,并运用SDS-PAGE进行鉴定。采用MTT分析细胞活力,瑞氏-吉姆萨染色法对细胞核进行分析,并测定细胞上清液中β-酪蛋白(β-CN)含量。结果显示:本试验成功培养出较纯化的奶牛乳腺上皮细胞;细胞生长曲线呈明显"S"型,用瑞氏-吉姆萨法染色细胞,细胞核形态多为卵圆形且呈现明显蓝紫色。原代乳腺上皮细胞可连续多次传代且未出现永生化,细胞呈单层贴壁生长,证明细胞活力良好;测定其β-CN含量为3.3 mg/L。     

奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及β酪蛋白mRNA的表达

本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展

体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)常被用于研究乳成分的合成调控以及乳腺的生理代谢.近年来,随着越来越多永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立,其应用也更为广泛.本文综述了奶牛乳腺细胞系的种类和奶牛乳腺细胞体外培养的方法,为研究乳腺上皮细胞的功能及泌乳机制提供参考.     

蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

研究蛋氨酸与乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的关系。建立体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型,采用高效液相色谱法、实时荧光定量PCR、细胞活力分析仪、甘油三酯试剂盒检测不同浓度蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L)对体外培养24h的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响。结果表明,蛋氨酸在1.2mmol/L时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显,乳糖分泌量最高,β-酪蛋白mRNA表达量最高且甘油三酯合成最多(P<0.01)。     

芦丁对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长的影响

本实验旨在研究芦丁对奶牛乳腺上皮细胞生长的影响,实验将奶牛乳腺上皮细胞分成5组,每组细胞培养基中分别含有0、25、50、100、150μg/mL芦丁,细胞在37℃,5%CO2条件下培养48 h和96 h后测定相关指标。结果表明:细胞培养48 h,与0μg/mL芦丁组相比,100μg/mL芦丁组的细胞活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著提高,而丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著降低;细胞培养96 h,100μg/mL和150μg/mL芦丁组的细胞活性、GSH-Px和SOD活性均显著提高,而MDA含量和CAT、LDH活性均显著降低。与0μg/mL芦丁组相比,100μg/mL芦丁组细胞的Bcl-2表达显著升高,而Caspase3和P53表达均显著降低。综上,芦丁能够提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力和抑制细胞凋亡,进而促进细胞的增殖,其中添加100μg/mL芦丁的效果最好。     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

用外科手术的方法采取健康的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用机械剪切结合酶消化的方法,在体外进行原代乳腺上皮细胞分离培养。结果成功地培养出荷斯坦奶牛原代乳腺上皮细胞。显微镜下观察,细胞形成单层呈鹅卵石样;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应。经数次传代后,细胞增殖依旧旺盛。     

体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察

荷斯坦奶牛是我国饲养的主要奶牛品种。研究荷斯坦奶牛乳腺发育的生理、病理对于奶牛育种和保障奶牛健康均具有重大意义。因此，进行荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞分离培养及形态学研究，可为今后的工作奠定基础。本研究在形态学方面对培养的乳腺上皮细胞进行了系统的阐述，以期对今后的研究提供借鉴。     

奶牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及超微结构鉴定

通过组织贴块法取部分奶牛乳腺组织进行培养,并通过在培养基中添加适当浓度的营养因子以及控制消化时间将成纤维细胞去除,纯化出原代奶牛乳腺上皮细胞。通过免疫荧光鉴定,形态学观察,扫描电镜和透射电镜检测原代乳腺上皮细胞特性。观察结果显示,本试验分离培养的牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光染色鉴定结果呈阳性。形态学观察及超微结构观察显示,试验所分离的上皮细胞呈鹅卵石样单层聚集,胞内有丰富的线粒体和内质网,细胞状态良好,传至15代以上细胞依然增殖旺盛,因此可以作为研究奶牛乳腺机能的重要工具。     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

苜蓿黄酮对热应激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

本实验旨在研究苜蓿黄酮对热应激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞的影响。将乳腺上皮细胞分成5组,每组培养基中分别含有0,25,50,75和100 μg/mL苜蓿黄酮,同时置于细胞培养箱37℃,5%CO₂培养72 h,再在 42℃恒温水浴锅中热应激1 h后返回细胞培养箱培养12 h,检测细胞活性、抗氧化指标和相关基因的表达。结果显示:1)添加25 μg/mL组的细胞活性显著高于0和50 μg/mL组(P<0.05),其他各组之间差异不显著。2)相对于0 μg/mL组,50~100 μg/mL组细胞的GSH-Px活性升高(P<0.01),LDH和MDA含量降低(P<0.01或P<0.05),而CAT活性无显著性差异。3)相对于0 μg/mL组,50和75 μg/mL组Caspase3和Socs3基因表达降低(P<0.01),25 μg/mL组P53、Stat1和Socs1基因表达升高(P<0.01或P<0.05),而Bcl-2和Fas基因表达无显著差异。综上所述,在热应激下,苜蓿黄酮能够提高体外培养奶牛乳腺上皮细胞的活性,改善抗氧化能力和抑制细胞凋亡,其中添加75 μg/mL效果较好。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Met对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理(每个处理6个重复),培养液中Met浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。在37℃、5%CO2条件下培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Met浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。0.52~0.78 mmol/L Met处理BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)和PPARγ基因的相对表达量均显著高于其他处理(P0.05)。BMECs内脂蛋白脂酶(LPL)基因的相对表达量以0.26~0.39 mmol/L Met处理较高,显著高于0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。脂肪酸合成酶(FASN)基因的相对表达量以0.39~0.52 mmol/L Met处理较高,且0.52 mmol/L Met处理显著高于0.13~0.26 mmol/L和0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。Met浓度可显著影响SREBP1和乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达(P0.05),均以0.26 mmol/L Met处理的相对表达量最高。结果表明,Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因的表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1的基因和蛋白的表达,Met浓度为0.26~0.52 mmol/L时对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶＋0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异（P〉0.05...     

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶+0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P>0.05),但明显高于其他处理组(P<0.01)。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响.试验结果表明,0.25％胰酶+0.20％Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5％与10％浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5％与10％浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P＞0.05),但明显高于其他处理组(P ＜0.01).     

奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

本试验通过组织块培养法获得了奶牛乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化,应用倒置显微镜和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,鉴定该细胞为上皮型细胞。     

奶牛bTAP蛋白表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。