重组牛IFN-τ的纯化及其抗病毒活性的鉴定

为测定重组牛IFN-τ(rbIFN-τ)的抗病毒活性,以含有rbIFN-τ重组表达质粒pGEX-IFN-τ的BL21(DE3)菌株为材料,使用自动诱导方法进行重组蛋白的诱导表达,表达包涵体经洗涤溶解后进行了切胶纯化,纯化蛋白透析复性后用细胞病变抑制法测定了其抗病毒活性。结果获得了纯度较高的rbIFN-τ,透析复性后其抗病毒活性为1.5×105 U/mg蛋白。这为进一步研究和应用rbIFN-τ奠定了基础。     

重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素（BoIFN-α）的分泌表达系统并分析其抗病毒活性。根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性,对BoIFN-α基因进行优化合成。将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切,将胶回收产物进行连接后,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定,同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右,进行体外抗病毒试验。结果显示,试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363,重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带,表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中。浓缩后的重组BoIFN-α（rBoIFN-α）上清与水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）同时作用,用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×10⁶ U/L;通过Alamer Blue法分析可知,加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小;间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光,说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果;实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果。本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌,通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性,试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径。     

惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β基因在大肠杆菌中的表达及其抗病毒活性比较

构建了惠阳胡须鸡IFN-α/pGEX-6P-1I、FN-β/pGEX-6P-1的重组质粒,并在BL21中表达,对重组蛋白进行了抗病毒活性测定,结果表明IFN-αI、FN-β重组蛋白的抗病毒活性分别为7.9×105U/mg和6.4×104U/mg,IFN-α的抗病毒活性是IFN-β的12倍。IFN-αI、FN-β与干扰素受体具有不同的结合位点和结合途径可能是使IFN-α和IFN-β的生物学活性存在较大差异的原因。     

在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础.     

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素（DuIFN—α）并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a＋连接后转化到BL21（DE3）获得工程菌BL21（DE3）／pET32a＋DuIFN—α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒（VSV）、鸭瘟强毒（DPV）活性进行研究。结果表明：BL21（DE3）／pET32a＋-DuIFN-α经0．4mmol／LIPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质（Ni—MIAC）进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12800U／mg;利用定量PCR检测到15U／mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN—α的临床应用提供试验数据。     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID₅₀猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID₅₀。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制P...     

牛α0干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性鉴定

克隆牛α0干扰素(BoIFN-α0)成熟肽基因,使其在真核细胞中表达,并研究其表达蛋白质的活性。通过PCR方法扩增得到BoIFN-α0成熟肽基因,然后将其连接到含分泌信号肽序列的Pichia pastoris表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0,重组质粒经PmeⅠ酶切线性化后电转化宿主菌GS115。转化子经100μg·mL-1 zeocinTM筛选和PCR鉴定,阳性重组菌经甲醇诱导后实现了BoIFN-α0在毕赤酵母系统中的分泌表达。结果表明:SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产物相对分子质量约为18和21ku,推测表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制试验结果表明,重组BoIFN-α0具有较高的抗病毒活性,达到5.72×106 U·mg-1。这些研究结果为牛IFN-α的更深层次应用奠定了基础。     

惠阳胡须鸡IFN-α基因的克隆表达和重组蛋白的抗病毒活性圆二色性分析

IFN-α是一种具有很强抗病毒活性的细胞因子.从惠阳胡须鸡肝脏克隆了IFN-α基因,为新的亚型.将IFN-α成熟肽与毕赤酵母pPICZαA连接,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后确定目的基因无突变并且插入方向正确,将重组质粒转化到GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达,重组IFN-α分子量约为35 kD,表达量达到了0.307 mg/ml,在CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性为3.2×106 U/mg.圆二色实验结果表明IFN-α重组蛋白中含有53.2% α螺旋、3.1% β折叠、10.6%转角和33.1%无规谱卷曲,属于全α型蛋白.结果表明,采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-α,并首次证实鸡IFN-α属于全α型蛋白.     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析

为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析.结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和...     

牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定

为高效分泌表达牛α干扰素(boIFN-α),本研究通过人工合成boIFN-α基因,将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-boIFN-α,将其电转化于毕赤酵母菌株GS115,利用抗药选择压力G418筛选重组菌,对重组菌诱导表达,取上清进行SDS-PAGE和western blot检测,并优化重组菌的诱导表达条件.结果显示:筛选获得高效分泌表达boIFN-α的重组菌,其最佳诱导条件为:250 r/min,26℃培养,1％甲醇浓度诱导,诱导72 h.上清中目的蛋白表达量最高可达200 μg/mL,本研究为boIFN-α在生产中的应用奠定了基础.     

重组猪IFN-λ3原核表达及其活性分析

应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。     

牦牛IFN-α基因的克隆表达及抗病毒活性研究

从我国地方品种环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后与载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/BoIFN-α,将其转化JM109E.coli并用IPTG进行诱导表达。序列分析表明,环湖型牦牛和野牦牛IFN-α成熟肽基因全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸,其中环湖型牦牛IFN-α与已报道的8个BoIFN-α亚型氨基酸的一致性为92.8%~95.2%,野牦牛为88.6%~92.8%,均为BoIFN-α新亚型。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,重组蛋白约为20kD,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。经包涵体提取、尿素变性和复性后,重组牛IFN-α粗提物在MDBK/VSV和CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为1.6~1.8×106U/mg和2.3×105U/mg,而且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)也有一定的抑制作用。     

重组鸡α-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×10⁶ IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。     

牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33％,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95％,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5．56×10^6 u／mg。     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。