大麦黄矮病毒运动蛋白在烟草中的瞬时表达

[目的]快速鉴定运动蛋白基因在烟草中的瞬时表达,进一步研究该外源基因的功能。[方法]将大麦黄矮病毒的运动蛋白基因定向克隆到马铃薯X病毒载体上,得到重组的马铃薯X病毒,电击转化农杆菌后,利用农杆菌渗透注射技术注射到本生烟草的叶片中,观察病毒对烟草的侵染状况。[结果]渗透注射后第7天观察,重组病毒载体侵染的烟草系统叶有病毒侵染症状,而对照组未有此现象。对2组试验进行逐日跟踪观察,重组病毒载体侵染的烟草有较严重的病毒侵染症状和叶片卷曲现象,后期引起注射叶及系统叶坏死。而空病毒载体侵染的烟草只有轻微的病毒侵染症状,并能够恢复健康。对侵染的烟草进行RT-PCR检测,结果表明外源基因BYDV-MP在烟草体内进行了正常的转录和表达。[结论]BYDV-MP蛋白促进了PVX的系统侵染速度,加重了系统侵染的病毒症状,是病毒病症的决定因子;利用PVX表达载体表达异源MP的方法是可行的。     

马铃薯X病毒载体介导的人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)在烟草中的表达

【目的】利用马铃薯X病毒(PVX)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的hFGF21-smGFP融合基因和hFGF21基因克隆进PVX表达载体,构建重组表达质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。采用冻融法将质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP、pgR107-smGFP和pgR107-His-hFGF21转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟的叶片,采用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA检测hFGF21-smGFP和hFGF21蛋白的表达情况。烟草叶片表达的融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,再用重组牛肠激酶(rbEK)裂解,获得纯度较高的重组hFGF21活性蛋白。hFGF21调节葡萄糖吸收活性用微量化的GOD-POD法检测。【结果】成功构建了植物病毒双元表达载体pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。表型观察发现,侵染第7天,烟草外源蛋白积累最高,smGFP和hFGF21-smGFP蛋白的积累主要在细胞质中。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA分析表明,hFGF21重组蛋白可在烟草中有效表达,表达量高达500μg/g(鲜叶质量)。生物活性检测结果表明,纯化的hFGF21蛋白可以促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收。【结论】利用PVX病毒载体,在本氏烟草中表达的重组hFGF21蛋白具备生物活性。     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-PAV,MP）形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系。[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体。电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象。[结果]农杆菌渗透注射后,2～5d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象。[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了依据。     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-PAV,MP）形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系。[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体。电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象。[结果]农杆菌渗透注射后,2～5d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象。[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为进一步深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了理论依据。     

桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

马铃薯X病毒复制酶基因载体的构建及在烟草中的转化

[目的]构建马铃薯X病毒复制酶基因（RdRp）的载体,并将其在烟草中转化。[方法]将RdRp基因分为3个片段,分别连入表达载体中,其中基因5＇端和3＇端序列通过PCR方法获得,中间序列通过酶切从病毒载体pGR107上获得。最后将构建成功的载体转入烟草中进行表达。[结果]表达载体pK1390＋RdRp被成功构建;获得PCR初步鉴定为转基因的植株50多棵。[结论]为研究植物病毒机制提供了依据,也为利用杂交手段得到外源蛋白高效表达的双转基因植物奠定了基础。     

烟草瞬时表达人表皮细胞生长因子(hEGF)

构建人表皮细胞生长因子(hEGF)病毒表达载体,为实现h EGF在烟草中瞬时表达提供理论和实验依据。PCR扩增获得hEGF基因,将其连接到马铃薯病毒表达载体pGR107上,利用农杆菌介导法感染烟草叶片,对其进行转录水平和翻译水平检测。根据GFP的表达确定收获hEGF时间为病毒侵染叶片后第7天;RT-PCR检测的结果表明hEGF基因在转录水平有表达;Western blotting、ELISA和MTT结果表明感染烟草叶片中有hEGF蛋白表达,表达量为总可溶蛋白的0.0103%,且具有生物活性。     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白N端保守脯氨酸对病毒致病性的影响

木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)是棉花曲叶病的主要病原之一,其V2蛋白在病毒致病过程中起重要作用。本研究对V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析。通过构建马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体(PVX-V2、PVX-V2^P4A),利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,PVX-V2能够增强PVX异源病毒的致病性,致使PVX在植物体内复制量增加,而PVX-V2^P4A对PVX异源病毒致病性的影响相对较小。通过构建V2基因突变体(ΔV2、V2^P4A)侵染性克隆,利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,ΔV2、V2^P4A侵染性克隆引起的症状较野生型更弱。结果表明,CLCuMuV V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用。     

植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP）,为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV／CP／W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100％,表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。     

烟草花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因片段的瞬时表达诱导对PVX的高抗性

为获得抗马铃薯X病毒(PVX)的植株,从疑似感染马铃薯X病毒的马铃薯叶片中提取出PVX cp cDNA,将其保守片段插入到RNAi质粒PHellsgate12中以构建编码发夹结构RNA的载体,通过Agroinfiltration的方法在本氏烟植株中瞬时表达.结果表明:病毒侵染10 d后,15株引入该载体的本氏烟植株对PVX均具有抗性,此载体可用于产生对马铃薯X病毒具有高抗性的转基因植物.     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆与系统进化分析

从贵州威宁等地采集马铃薯病叶样本,采用试管捕捉反转录PCR（tube-capture-RT-PCR,TC-RT-PCR）的方法克隆出714 bp的PVX CP基因,编码237个氨基酸残基.系统进化分析表明,PVX CP基因可分为两大类群,推测分离物属于X3株系,并建议重型花叶也可作为PVX病叶样本.     

利用原核表达的衣壳蛋白制备马铃薯x病毒的抗血清

本研究构建了含马铃薯x病毒（pvx）衣壳蛋白（cp）基因的原核表达载体,利用在大肠杆菌内表达的马铃薯x病毒cp制备了效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带pvx情况的检测。     

转水稻条纹病毒NS3本氏烟的抗病性

【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟（Nicotiana benthamiana）对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）,观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00％、98.33％,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67％,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00％、86.67％,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。     

PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响

 以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。     

EffectS Of Synergism Between PVY and PVX on Vi rus Titer and Cell Ultrastructure in Tobacco Plants

The viruses titer and the ultrastructure of infected cells in tobacco host (Nicotiana tabacum cv.Samsun), which doubly infected with potato virus Y necrosis strain (PVYN) and potato virus X (PVX), were studied under greenhouse conditions. The results indicated that PVYN and PVX interacted synergistically, and tobacco plants which doubly infected with PVX and PVYN could greatly increase symptom severity as compared with that induced by the single virus. As determined by triple antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA), the titer of PVX in the tobacco leaves infected with both PVYN and PVX was up to 9.10 times higher than the plants infected with PVX only. No significant differences in PVYN titer were detected between singly and doubly infected plants. The enhancement of PVX titer in doubly infected plants was evident in greenhouse and was independent of the virus strains, tested seasons, intervals between PVYN and PVX inoculation. When sections of doubly infected leaves were examined with an electron microscope, it could be frequently found that cells contained pinwheels and large masses of PVX-like particles, pinwheels and laminate inclusions, or all three structures, most of them were swollen, and their chloroplast and other organella were destructed heavily. This suggested that doubly infected cells were involved in the enhancement phenomenon,which seemed to be the result of an increase in the amount of PVX synthesized in them.     

激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选

采用病毒诱导基因沉默技术从本氏烟(Nicotiana benthamiana)cDNA文库中筛选受3种不同激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡的调控基因。以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有7 000个单克隆的本氏烟cDNA文库,采用牙签刺伤法和注射接种法,从6 000个克隆中筛选到了34个能使激发子诱发的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中13个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆Nb14-4编码1个特异的ALY蛋白;克隆Nb3-9和Nb4-26分别编码1个苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶;Nb4-28编码普通烟草中的14-3-3 d-2蛋白。还有21个克隆在公共数据库中没有同源基因。上述结果表明:利用病毒表达载体建立cDNA文库,并采用病毒诱导基因沉默技术可从烟草全基因组内筛选受不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,为揭示植物过敏性细胞死亡分子机制提供试验依据。