鲫CyHV-2病毒病的诊断及组织病理损伤研究

【目的】为了确定一例鲫(Carassius auratus)鳃出血症的病原。【方法】无菌操作条件下从患病鱼的肝脏、脾脏等病原灶处分离病原菌;利用压片法取鳃丝、体表粘液进行观察,检查是否有寄生虫感染;取鳃、肝脏、脾脏、肾脏用聚合酶链式反应(PCR)技术检测鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),并构建系统发育树,结合组织病理学技术以分析鳃出血症的病因。【结果】结果发现,病鱼尾鳍末端发白,鳃丝出血、末端轻微溃烂,有少量红色腹水;寄生虫学检测未发现鳃丝和体表黏液有寄生虫寄生;通过微生物学诊断,未见病原菌生长;PCR检测结果显示患病鲫体内CyHV-2呈阳性;组织病理学检测表明,患病鲫的主要损伤靶器官为脾脏、鳃、肾脏、肠道、心脏和肝脏,主要引起重度鳃出血和坏死性鳃炎,重度坏死性脾炎、中度至重度肠炎、中度至重度坏死性肾炎、中度坏死性心肌炎和中度心内膜炎和轻度坏死性肝炎。【结论】推断本次鲫鳃出血症为CyHV-2感染导致。     

用微载体系统培养PK15细胞生产猪圆环病毒2型

研究了生物反应器、转瓶、方瓶3种不同培养系统生产PCV2,对转瓶不同参数下的病毒效价情况进行了比较和优化,最终确定培养参数为:以1∶10稀释种毒后接种、接种24 h的PK15细胞、5～7 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+2 g/L水解乳蛋白(LH)的培养方式效果最为理想;采用微载体和反应器系统生产PCV2,病毒效价可达105.0 TCID50/mL以上.     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72 h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型 ( Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2) ORF4蛋白的功能, 通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因, 并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4, 将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4; 采用脂质体法转染S...     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

自然感染鲤疱疹病毒Ⅱ的病毒载量研究

通过建立靶向于鲤疱疹病毒Ⅱ(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)胸苷激酶基因(TK基因)的荧光定量PCR法,分别检测了自然感染Cy HV-2的金鱼、鲫样品,并结合人工感染试验,分析了脾和肾组织内Cy HV-2的载量及其引发的组织病理变化。结果表明,自然感染Cy HV-2的金鱼和鲫的病毒拷贝数范围为102~105,人工感染Cy HV-2的异育银鲫在感染后第五天脾和肾组织内病毒的拷贝数高达1010。人工感染条件下鱼体呈现系统性病理损伤,自然感染状态下鱼体脾和肾的病理变化分别表现为细胞嗜性的转变和炎症。     

Vero细胞两阶段扩大培养工艺研究

两阶段珠到珠转移方法（包含最初8h的间歇搅拌和接下来的连续搅拌阶段）可以实现Vero细胞的扩大培养,按照新老载体2：1的比例放大,载体空载率能从最初的66．7％降到3．5～6．3％。在间歇搅拌阶段,转速对新载体建桥率没有显著影响,但在连续搅拌阶段,60r／min转速仅能使载体空载率降低到28．9％,甚至比35r／min连续搅拌产生的空载率还高8％。在新老载体1：1放大过程中,5eg／mL的胰酶不能促进细胞在载体Cytodex-3间的转移,最后的载体空载率仍高达10．8％。这些研究结果为Vero细胞通过珠到珠转移方式在其他系统或以更大扩增倍数进行的放大培养过程提供了重要信息。     

乳鼠心肌细胞在旋转生物反应器中的微载体培养初探

实验尝试在旋转生物反应器(RCCS)中采用微载体培养技术对心肌细胞进行快速培养。采用顺序消化和差速贴壁法分离纯化1~2日龄新生大鼠的心肌细胞,并将其在RCCS内应用Cytodex-3微载体进行培养,于倒置显微镜和扫描电镜下对微载体表面的细胞进行动态观察,同时测定细胞的代谢活性。结果表明,心肌细胞可快速贴附于微载体表面,细胞伸展后生长加速,并可形成心肌细胞-微载体团块,细胞代谢旺盛,说明在RCCS内应用微载体培养技术可简便、快速地在体外培养心肌细胞,是心肌细胞培养的一条可行途径。     

襄阳市规模化猪场猪圆环病毒2型抗体水平研究

[目的]了解襄阳市规模化猪场猪2型圆环病毒的免疫水平。[方法]2013年1~12月对襄阳市27家规模化猪场已接种PCV2疫苗的母猪和保育猪采集1 150份血样,采用ELISA方法对猪群血清中PCV2的抗体水平进行检测。[结果]在检测的1 150份血样中,阳性数814份,总体阳性率为70.8%。其中,抗体弱阳性样本456份,占39.7%;抗体强阳性样本有358份,占31.1%。[结论]应对襄阳市猪群PCV2免疫程序进行优化,提高PCV2的血清抗体浓度,从而控制猪群PCV2的疫情。     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第2轮细胞克隆,之后用同步接种法和异步接种法将PCV2感染A10细胞,并检测A10细胞接毒后的PCV2 DNA 含量,2种接毒方法获得的最高PCV2基因组的拷贝数分别为3.0×109、6.2×109/mL,高于用PK15混合细胞培养PCV2所获得的最高PCV2基因组拷贝数(107/mL)。综合以上结果,构建的PK15均质细胞克隆株比PK15混合细胞更适合PCV2的培养。     

奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养及形态观察

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。     

Staurosporine 对人低分化鼻咽癌细胞系细胞周期和 DNA 倍体含量影响的动态观察

目的：探讨蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）诱导ＣＮＥ－２Ｚ细胞凋亡时,对细胞周期的选择性和对ＤＮＡ含量及细胞周期的动态影响。方法：以ＰＫＣ催化区抑制剂ＳＴ作用于ＣＮＥ－２Ｚ细胞不同时间后,收集细胞进行ＰＩ染色和流式细胞仪检测。结果：ＳＴ以２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ终浓度分别作用至３,６,１２,２４ｈ后,发现Ｇ２期百分比分别为３０．４３±７．１６、３０．８３±６．２５、４２．４３±３．９８和７１．８０±７．５５,均较对照组１２．０８±３．４９增高明显。比较差异有显著性（Ｐ＜０．０１）;而Ｇ１期在３,６,１２,２４ｈ分别为３４．７０±１．５６,３７．０３±６．４７,１６．６３±１．７７和１５．３０±５．４６,均较对照组６２．５６±６．５７明显降低,比较差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。亚二倍体峰百分比在１２、２４ｈ分别为３７．１０±７．２１和４３．７２±６．７３,均较对照组９．８１±１．７８显著增加（Ｐ＜０．０１）;而１２ｈ以前该峰增加不明显。结论：ＳＴ在终浓度为２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ诱导ＣＮＥ－２Ｚ细胞至１２ｈ后即可出现明显的ＤＮＡ含量降低的凋亡细胞,对Ｇ２期细胞敏感而使之逐渐阻滞,且存在     

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件.     

基于近红外漫反射光谱的规模化奶牛场粪水氮磷定量分析及模型构建

为建立规模化奶牛场粪水中氮磷含量现场快速检测方法,以实现准确预测的同时替代常规监测程序,选取23家天津市典型种养结合模式的规模化奶牛场,围绕粪水处理全过程环节依次开展样品采集、实验室常规化学检测、近红外漫反射光谱采集,并进行主成分分析和偏最小二乘分析,建立多种动态复合影响因素条件下的全局、全程快速检测定量分析模型。结果表明:主成分分析不仅反映出同一奶牛场粪水有机组分随处理环节的变化,而且也反映出不同奶牛场粪水样品的差异性,以及在粪水处理过程中各因素对后续模型的影响程度。建立的全过程环节定量分析模型对总氮含量预测结果与实际含量的线性拟合相关系数R为0.96,预测均方根误差RMSEP为187.80;对总磷含量预测结果与实际含量的线性拟合相关系数R为0.91,预测均方根误差RMSEP为3.59。建立的全局定量分析模型对总氮含量预测结果与实际含量的线性拟合相关系数R为0.96,预测均方根误差RMSEP为238.59;总磷含量预测结果与实际含量的线性拟合相关系数R为0.91,预测均方根误差RMSEP为6.56。研究表明,基于近红外漫反射光谱和偏最小二乘法对规模化奶牛场粪水处理全过程环节粪水样品中氮、磷含量进行定量分析是可行的;纵向模型比横向模型能提供更好的预测结果;近红外漫反射光谱技术可实时、快速、高效地对规模化奶牛场粪水处理全过程总氮和总磷进行跟踪和监控。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

JA_1对体外培养肝癌细胞线粒体膜电位及wt-p53基因表达的影响

为探索梯度浓度的JA1对体外培养人肝癌细胞株(HCC-9724)的细胞周期、细胞线粒体膜电位和wt-p53蛋白表达的影响.采用流式细胞技术和体外细胞培养技术,发现经JA1处理后的细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞在G1被阻滞.细胞线粒体膜电位(ΔΨm)明显下降,且表现出剂量和时间效应关系.而wt-p53蛋白阳性细胞百分率则随时间延长而逐渐增加.JA1诱导了HCC-9724细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡,而wt-p53蛋白表达的增强则是其诱导HCC-9724细胞凋亡的重要分子机制之一.     

病情指数划分小麦品种(系)赤霉病抗病性类型方法的改进研究

对小麦品种（ 系） 赤霉病抗病性鉴定资料分析表明,同一个品种（ 系） 的赤霉病病情指数年度间差异较大,采用相对病情指数法划分品种的抗病性,能够有效消除年度间的这种差异,保证当年鉴定结果的真实可靠     

崇明香酥芋茎尖培养和快速繁殖的研究

以崇明香酥芋为材料,研究消毒方式、茎尖直径、外植体接种时期、琼脂浓度、无机盐含量和活性炭浓度对芋茎尖分化和增殖的影响。结果表明：用饱和漂白粉溶液处理25min显著降低茎尖褐变率,而提高茎尖的分化率;芋茎尖直径0．3—0,5mm的分化率为51．7％;芋茎尖诱导的最佳时间为3～4月,茎尖分化率达64．4％;5．0g·L^-1的琼脂浓度茎尖的分化和试管苗的增殖显著高于其他处理;不同无机盐浓度显著影响茎尖褐变率,以1／2MS的茎尖分化率为最高;5．0g ·L^-1。的活性炭显著降低茎尖的褐变率,缩短转绿的时间并提高茎尖的分化率。     

高浓度CO2和1-MCP处理对磨盘柿脱涩和保脆效果的影响

以磨盘柿为试验材料,采用高浓度CO2和1-MCP双重处理,观察室温条件下的脱涩和保脆效果.结果表明,在20 ℃条件下90～95%CO2处理48 h能使磨盘柿完全脱涩,而80～85%CO2处理48 h,不能完全脱涩,同时1-MCP处理有助于抑制果实的呼吸作用,有效延缓了脱涩后果实的成熟和软化,可以明显抑制柿果实硬度、可溶性固形物含量、可溶性单宁含量的变化.0.50 μl/L浓度1-MCP处理的对硬度的保持作用好于1.00 μl/L浓度1-MCP.