EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.     

DDF2基因克隆及植物表达载体构建

采用CTAB法提取拟南芥叶片总DNA,根据已报道的DDF2基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到1条约550 bp的特异片段,把该片段连接到pGEM-T Easy Vector.上进行测序,结果表明:该基因编码区全长546 bp,为开放阅读框,共编码氨基酸181个,与报道序列完全一致.并构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-DDF2,采用冻融法将其转入根癌农杆菌,为后期该基因遗传转化花卉,改良花卉品质,并提高其抗逆性打下了一定的基础.     

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建

为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理,从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列,GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与进化树分析结果表明：GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因,GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达,接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达,推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体,为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

蝴蝶兰MADS-Box基因克隆及植物表达载体的构建

【目的】克隆蝴蝶兰MADS-Box基因并构建其正义和反义植物表达载体,为其功能研究奠定基础。【方法】以蝴蝶兰杂交品种(Phalaenopsis hybrid cv.Jiuhbao Red Rose)为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术从花葶中克隆MADS-Box基因,并构建正义和反义植物表达载体。【结果】克隆获得一个蝴蝶兰MADS-Box基因,命名为DtpsMADS1(GeneBank登录号JQ065097)。该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp的5'非编码区、185 bp的3'非编码区和一个738 bp的编码区;该基因编码245个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白质为碱性亲水性蛋白,具有62.45%的α-螺旋,8.16%的延伸链和29.39%的不规则折叠。序列比对和系统进化分析结果表明,DtpsMADS1与蝴蝶兰ORAP13的亲缘关系最近,同源性达99.0%,与石斛和蕙兰的同源性分别为83.0%和82.0%,属于MADS家族A类亚家族。将DtpsMADS1基因连接到植物表达载体pBI121上,构建获得正、反义植物表达载体pBI121-DtpsMADS1-S和pBI121-DtpsMADS1-A。【结论】成功克隆的蝴蝶兰DtpsMADS1基因属于MADS家族A类亚家族,具有明显的保守性和特异性,可为蝴蝶兰DtpsMADS1基因功能的鉴定及蝴蝶兰的遗传改良奠定基础。     

红麻TIR1基因克隆及其表达载体构建

[目的]分析红麻运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)基因在不同组织和不同发育时期花药中的表达情况,并构建其超量表达载体和干扰载体,为研究该基因在雄蕊发育中的调控功能打下基础.[方法]根据红麻花药转录组数据,利用生物信息学方法,克隆TIR1基因cDNA序列,实时荧光定量PCR(qPCR)分析TIR1基因在红麻保持系722B和不育系722A根、茎、叶及不同发育时期花药中的表达情况,并构建超量表达载体和干扰载体.[结果]TIR1基因的开放阅读框(ORF)为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号KY613992).qPCR检测结果显示,与不育系722B相比,不育系722A TIR1基因在四分体期花药中呈显著下调表达(P<0.05,下同),在茎和双核期花药中呈显著上调表达,在单核期花药中极显著上调表达(P<0.01);而在根和叶中,保持系722B和不育系722A中TIR1基因表达水平差异均不显著(P>0.05).超量表达载体pBI121-GFP-TIR1和干扰载体pART27-pK-Tz-Tf构建成功.[结论]红麻TIR1基因编码一个富含亮氨酸重复的F-box蛋白.红麻不育系722A的单核期花药TIR1基因表达较保持系722B极显著上调表达,可能与花药败育有关.构建的超量表达载体和干扰载体,可用于红麻TIR1基因功能及其与雄蕊发育的关系研究.     

毛栓菌漆酶基因克隆及其酵母表达载体的构建

[目的]研究毛栓菌漆酶基因克隆及其酵母表达载体的构建,为研制高品质酶制剂,实现其工业化生产和规模化应用奠定了基础。[方法]以毛栓菌总RNA为模板,通过RT-PCR克隆去信号肽的漆酶基因;通过BLAST比对,对毛栓菌漆酶基因序列的同源性进行分析;对质粒pPIC9K进行EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切,构建其酵母表达载体p9K+Lac。[结果]去信号肽的漆酶基因编码框全长为1 512bp,编码506个氨基酸,分子量为54 KDa;毛栓菌漆酶基因与NCBI中提交的毛栓菌基因序列同源性达到了99%。[结论]通过RT-PCR得到了漆酶基因全长,重组毕赤酵母表达载体p9K+Lac的构建是完全正确的。     

水牛NAAA基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（N-acylethanolamine acid amidase,NAAA）基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制,本试验采用了3'Race、生物信息学分析、载体构建和细胞转染等技术对NAAA进行了研究。结果表明：水牛NAAA基因的编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸;多重序列比较分析显示：水牛NAAA核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、96%、95%、87%、87%、85%和84%,结合系统进化树分析结果,NAAA基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对NAAA蛋白质的分析表明：该蛋白呈弱酸性,第26~27位氨基酸为其信号肽,细胞亚定位于溶酶体,存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛NAAA基因真核表达载体,转染293 T后,能够正确形成NAAA-EGFP融合蛋白,产生绿色荧光信号。研究结果为阐明NAAA基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

耐碱Mn-SOD基因克隆与真核表达载体的构建

以高产耐碱Mn-SOD产生菌Bacillussp.110-2总DNA为模板,通过PCR扩增得到耐碱Mn-SOD基因,编码一个完整的开放阅读框,共202个氨基酸,含18个碱性氨基酸,包括12个赖氨酸和6个精氨酸。与地衣芽孢杆菌同源性为99%,与极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)同源性为78.7%。克隆片段酶切后,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-SOD。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

激发子隐地蛋白(cryptogein)基因的克隆及其植物表达载体的构建

从隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)中克隆cryptogein蛋白激发子基因,经测序证实后.针对病原菌侵染和cryptogein基因本身的特点,选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型、并受病原菌诱导的水稻苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的启动子;同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外,更好地与植物细胞膜受体互作,在cryptogein基因前还融合了烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽.然后将此融合基因克隆到植物表达载体CHF3中,获得植物双元表达载体CHF3-PAL-PR1b-Cry,再将此载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中.     

水稻耐盐相关基因ZRP4的克隆及其植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。