毛白杨抗坏血酸过氧化物酶基因PtAPX2的克隆表达及分析

以毛白杨总RNA为模板反转录得到cDNA,克隆获得抗坏血酸过氧化物酶基因家族中的一个成员PtAPX2 864 bp的编码序列。该基因编码的蛋白包含287个氨基酸,理论分子质量为3178 ku,C末端包含锚定于过氧化物酶体跨膜结构域,推断其为过氧化物酶体定位蛋白。构建了PtAPX2原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了纯化的重组蛋白,并对其进行了酶学性质分析。PtAPX2对抗坏血酸的Km值为 (1.37±0.22) mmol/L,Vmax值为 (3.95±0.46) mmol/(L•min•mg);对H2O2的Km值为 (0.026±0.003) mmol/L,Vmax值为 (1.27±0.03) mmol/(L•min•mg);该酶在28 ℃,pH 7.0～7.4时活性最高。实时荧光定量PCR分析表明,PtAPX2在杨树老叶叶肉中表达量最高。对PtAPX2亚细胞定位、底物结合特征、酶学性质及组织特异性表达的分析加深了对木本植物抗氧化机理的认识。      

Cloning and analysis of APX gene promoter in Populus tomentosa

[目的]研究毛白杨抗坏血酸过氧化物酶(APX)的基因启动子在转录调控中的作用,为进一步探讨抗坏血酸过氧化物酶启动子在植物抗逆中的应用奠定基础.[方法]依据毛白杨与毛果杨基因的高度同源性,以毛果杨LG-IX染色体上抗坏血酸过氧化物酶启动子序列为模板设计引物,从毛白杨总DNA中克隆一段启动子序列.[结果]克隆出的抗坏血酸过氧化物酶启动子序列长1234 bp,与毛果杨同源基因的同源性高达81.96％.该启动子包含多种可能与胁迫相关的顺式作用元件保守序列,这些顺式作用元件参与光调节转录、激素信号和植物防御信号的应答,PpAPX-IX基因在老叶叶肉和老叶叶脉中表达较多,老叶中表达较多,在新叶中表达较少;在生长旺盛的部分比如根和形成层表达量很低或不表达.[结论]该启动子能为组织特异性启动子,受多种逆境胁迫产生的化学信号的诱导在成熟细胞中特异性表达,可以构建该启动子连接PBI101的表达载体.     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

荔枝抗坏血酸过氧化物酶cDNA的克隆和分析

[目的]为了对荔枝果皮中克隆的APX基因进行cDNA序列分析。[方法]采用RT-PCR和RACE技术从荔枝果皮中扩增克隆抗坏血酸过氧化物酶基因,利用NCBI的ORFFinder程序分析克隆基因的序列,然后将ORF转换成氨基酸序列,进行BLASTX和BLASTN分析,最后用dnasismax2.6pro软件将荔枝与胡瓜、加杨等8种植物进行APX氨基酸序列配比和进化树分析。[结果]该基因cDNA全长1118bp,含有645bp的ORF,编码214个氨基酸。它编码的氨基酸序列与胡瓜、加杨、龙眼、落花生、豌豆、芸苔、帕拉港橡胶树和紫花苜蓿编码的氨基酸序列的同源性分别为83%、89%、97%、78%、84%、75%、79%和85%。推测该蛋白的分子式为C1946H3249N645O827S142,相对分子质量为53466.5,等电点为5.16,理论推导半衰期大于10h。[结论]该基因的克隆与cDNA序列分析为采后荔枝果皮中抗坏血酸过氧化物酶的基因工程操作奠定了基础。     

枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX生物信息学分析及植物表达载体的构建

利用生物信息学软件对已获得的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA序列ZjAPX进行了同源性及功能位点等多项参数分析。结果表明,此序列为全长753 bp的开放读码框(ORF),编码251氨基酸,分子量为62.55 kDa,理论等电点为5.10,为一个膜外蛋白;序列保守性分析表明,该序列具有典型的铁氧化还原蛋白结合区域,属于一个典型的植物亚铁血红素过氧化物酶家族蛋白;氨基酸序列相似性分析表明,该蛋白与已知的其他植物抗坏血酸过氧化物酶APX具有极高的同源性,与可可树APX和陆地棉APX同源性均为93%,命名为ZjAPX(DDBJ/EMBL/GenBank注册号:AB608053)。用Swiss Model程序(http://au.expasy.org/tools/)推测了ZjAPX基因编码蛋白的三维结构。以ZjAPX的cDNA序列为模板,PCR扩增后,经限制性内切酶消化,与PEZR(K)-LNY载体进行重组连接,测序结果显示,其植物表达载体构建成功。此结果为研究枣树抗坏血酸过氧化物酶基因在植物体内的生物学功能以及可能的活性调节方式奠定了基础。     

向日葵抗坏血酸过氧化物酶的电子克隆和生物信息学分析

利用电子克隆技术得到长753 bp的向日葵抗坏血酸过氧化物酶(HaAPX)cDNA。通过生物信息学分析发现,HaAPX在核酸水平和蛋白质水平上都与常见物种的APX非常相似,具有极其保守的酶活作用域Peroxidase-1(-divtlsggHtl-)和Peroxidase-2(-aplmlRlawHsa-),且配体结合位点和金属结合位点完全保守。HaAPX与甘薯(Ipomoea batatas)APX亲缘关系很近,其编码蛋白由250个氨基酸组成,分子量为2.7 ku,无信号肽和跨膜区,二级结构由37.6%α-螺旋、13.2%β-折叠、9.2%β-转角和40%无规则卷曲组成,三维构象与豌豆APX的非常相似。     

番茄抗坏血酸过氧化物酶研究进展

逆境会使植物细胞中积累过量的活性氧,引发氧化胁迫,抑制植物的生长发育。抗坏血酸过氧化物酶(APX)可以清除植物体内尤其是叶绿体中的H2O2,从而提高植物对氧化胁迫的耐受性。综述了番茄APX的基因克隆、基因表达调控及基因工程的研究进展。     

家蝇幼虫体内过氧化物酶过氧化氢酶抗坏血酸过氧化物酶与抗药性的关系——I.H_2O_2对酶活性的影响

采用室内饲养试验方法，研究了H2O2对家蝇幼虫体内过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(AsA—POD)活性的影响。结果表明，外源H2O2能不同程度地影响以上3种酶的活性，但变化规律却有明显差异：CAT活性变化的基本趋势是随着龄期的增加而递增，处理组最大值分别是对照组的1．2、1．26、1．47倍，另外在1、2龄幼虫中CAT活性出现了对照比处理高的现象，而3龄幼虫则没有出现。经H2O2处理后的1、3龄幼虫体内的POD出现了2个活性峰，1龄幼虫被处理后，在第1个活性峰出现的时间内对照明显比处理高，且持续时间约为5h，然后酶活性骤然上升，活性高峰值是对照组的6．8倍；2龄幼虫只有1个活性峰，是对照组的3．68倍；3龄幼虫体内的POD也有2个活性峰出现，分别是对照组的4．9、2倍。AsA—POD活性在整个实验过程中没有出现对照高于处理的现象，1、2龄幼虫经过处理后出现了2个活性峰，分别是对照组的1．3、1．3倍和2．08、1．73倍，3龄幼虫则只有1个活性峰，是对照组的1．8倍。     

不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。     

过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶对镉胁迫下水稻根系生长的影响

[目的]研究过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）与镉胁迫水稻根系生长发育的关系。[方法]以水稻中花11号为材料,研究Cd、Cd＋CAT抑制剂和Cd＋APX抑制剂处理条件下水稻幼苗的变化。[结果]在Cd胁迫下,抑制CAT活性,导致地上部分的生长受到显著抑制,引起不定根和侧根数量的减少,但显著促进了不定根和侧根的伸长生长;同时,初生根和不定根上第一侧根距根尖的距离也比对照的增加。抑制APX活性,水稻的生长变化与CAT抑制剂处理的类似。[结论]在正常和胁迫条件下CAT和APX对水稻的生长可能具有重要的调节作用。     

杨树PtoCIPK2基因的克隆和表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CIPKs)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用.以2个月龄的杨树(Populus tomentosa Carr.cv ‘BJHR01’)幼苗总RNA反转录的cDNA为模板,克隆得到PtoCIPK2(GeneBank登录号:KF225478)基因全长cDNA序列.该基因包含1 395 bp开放读码框,编码464个氨基酸,预测蛋白分子量为52.8 ku,等电点为9.19.蛋白质结构分析表明,PtoCIPK2具有保守的蛋白激酶结构域和NAF结构域.Real-Time qRT-PCR分析表明,PtoCIPK2在杨树幼苗主根、茎和叶片中均有表达,在叶片中的表达量最高,约为其在茎中表达量的4倍.PtoCIPK2响应了NaC1(300 mmol/L)、干旱和ABA (200μmol/L)的胁迫.在NaCl和干旱胁迫12 h后,PtoCIPK2的表达量分别上调了28和8倍,推测该基因在响应高盐和干旱胁迫时起重要作用.     

毛白杨木质素合成酶基因F5H克隆与生物信息学分析

克隆毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)基因全长序列,并通过生物信息学分析,为进一步研究F5H基因功能提供基础.利用RT-PCR方法成功从毛白杨741组培苗叶片中克隆了F5H基因,并对F5H基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括疏水性-亲水性、氨基酸翻译后修饰、亚细胞定位、跨膜结构域、蛋白质二级三级功能结构域等进行分析预测和推断.获得的基因长度为l 686 bp,编码区1542 bp,与已公布的毛果杨F5H mRNA序列(GenBank登录号为AJ010324)的编码区相似性达97.45％,并与其他植物的该基因序列具有同源性.F5H是亲水性较强的蛋白,整条肽链有1个跨膜结构域;通过亚细胞定位表明F5H主要位于质体中,并含有磷酸化位点有19个.F5H含有丰富的二级结构,卷曲占44.44％、折叠占7.02％、螺旋占48.54％,并预测了其三维结构.分析结果显示,植物的阿魏酸-5-羟基化酶是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,在内质网等分泌途径中表达.     

毛白杨4CL基因家族的克隆与进化分析

为研究毛白杨4CL基因家族及其进化关系,采用TRIZOL法单独提取毛白杨各组织的总RNA,以反转录得到各个组织的总cDNA为模板,通过PCR技术克隆18个毛白杨4CL基因。利用MEGA软件对这18个基因以及其他25个来自不同物种的4CL基因进行了进化树分析,结果显示,毛白杨4CL基因分为两个聚类:ClassI和ClassII,4CL1～4CL5属于ClassI,而4CL6~4CL18属于ClassII。     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

毛白杨PtYABBY基因家族3个成员的克隆与表达分析

  目的  YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。  方法  以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。  结果  PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。  结论  YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。      

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

毛白杨PtPCP—like基因的克隆及其遗传转化初报

利用滤纸吸附噬菌体 PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtPCP-like基因cDNA全长序列,测序表明克隆得到的该序列全长595 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码91个氨基酸;经BLAST分析发现,该基因包含与拟南芥花粉外被蛋白基因相似的序列,命名为PtPCP-like。采用RT PCR技术检测PtPCP-like基因在各个组织部位的表达模式,结果显示在毛白杨的根和雄花芽中表达丰度最高,而在雌花芽部位表达丰度最低。并且构建35S∶∶PtPCP-like植物表达载体,采用农杆菌介导法将PtPCP-like基因导入烟草中,获得了一批阳性转化植株。采用qRT-PCR技术检测PtPCP-like基因在各个转基因烟草中的表达模式,结果显示在转基因烟草中各个株系均比野生型表达量高,且不同株系间相对表达量差异显著。      

毛白杨AP2/ERF 类转录因子PtoSHN 的克隆及分析

AP2/ERFs是一个庞大的转录因子家族,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用.以毛白杨(Populus tomentosa)为材料,克隆了毛白杨AP2/ERF类转录因子PtoSHN的编码区序列.组织表达特异性结果显示,PtoSHN基因在毛白杨茎中高水平表达.系统进化分析表明,PtoSHN与拟南芥AtSHN2和AtSHN3相似度较高,其中AtSHN2已被证明参与了植物次生壁的合成调控.通过亚细胞定位预测,PtoSHN定位于细胞核内.亚细胞定位结果表明,PtoSHN定位在核内.表明已成功克隆到毛白杨SHN基因,该基因可能在林木次生生长过程中起调控作用.