Ac/Ds transposon system and its application strategy on construction of rape mutants pool

随着油菜基因组测序工作的完成和后续完善,油菜功能基因组学必将成为研究热点,如何构建高通量的突变体库则是影响其进展的关键.Ac/Ds( Activator/Dissociation)系统是构建插入型突变体库的理想技术,在水稻(Oryza Sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等异源植物中应用较广,但在油菜中尚处于起步阶段.文章介绍了Ac/Ds系统的结构特点、转座机理等基本概况,阐述了利用Ac/Ds系统构建植物突变体库的优势及存在的问题.结合模式植物水稻和拟南芥的研究成果,进一步分析了利用Ac/Ds系统构建油菜突变体库的改进策略,并对其在油菜功能基因组研究中的应用前景进行了展望.     

植物中Ac/Ds转座子的研究与应用

Ac/Ds转座子作为研究较为深入的植物转座子,已被广泛应用于植物功能基因组研究.利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库是研究功能基因组学的有效途径,也是进行基因克隆及功能分析的有利工具.结合课题组利用Ac/Ds转座子标签分离基因并进行基因功能验证方面的研究工作,综述了Ac/Ds转座子在植物基因组中的插入特点、转座机制以及转座子标签法的应用与发展前景,为更有效的利用Ac/Ds转座子提供参考依据.     

Ac/Ds转座子激活标签技术研究进展

随着植物基因组测序工作的迅速发展,植物功能基因组学已经成为植物分子生物学研究的重要内容,而大量有表型的突变体是进行功能基因组学研究的重要基础。Ac/Ds转座子激活标签技术(Ac/Ds transposonactivation tagging system)的产生使Ac/Ds转座子标签技术具有了产生显性突变的功能,并可避免在突变体库创建过程中进行大量繁重的人工转基因操作,是比较理想的植物功能基因组学研究工具。本文将对Ac/Ds转座子激活标签技术在发展过程中利用不同激活标签创建植物突变体库的研究进行介绍,并对近二十几年来报道的相关应用研究展开论述,以期对该领域的技术进步和应用研究提供一些有益的启发和参考。     

水稻Ds标记的曲穗突变体的分子鉴定

在经过Ac/Ds基因标签系统获得的水稻Ds插入突变株系中得到1株水稻曲穗突变体植株,对该突变体进行初步表型观察,结果显示,成熟期突变体植株的稻穗有一定的弯曲;同时采用TAIL-PCR方法获得曲穗突变体Ds侧翼基因序列,结果证明含有1个Ds插入位点;对Ds侧翼序列进行分析发现,Ds插入在2个基因之间,其下游是编码类泛素特异性蛋白酶1(Ulp1)的基因,该基因与穗的形成有一定的关联;利用RACE技术扩增Ds插入位点下游基因的c DNA的3'端序列,序列比对发现,Ds插入前后其下游基因序列无变化。预测Ds的插入影响了Ulp1基因的启动子区域,进而影响水稻的花序生长发育形成穗弯曲水稻突变体。本研究结果可能在穗型的遗传及发育以及改良优质高产水稻方面有一定的作用。     

Ac/Ds转座子及其作为插入序列标签的应用

简要介绍了Ac/Ds转座子作为插入序列标签的构建形式及其在植物基因组中的插入特点、影响Ds转座子跳跃的因素,并且对其在植物功能基因组的发展前景作了分析。     

不同基因型水稻再分化培养的比较研究

采用水稻Ac/Ds插入突变株系及野生水稻种子为外植体,从成熟胚盾片诱导愈伤组织.通过用不同培养基、不同植物生长调节物质浓度配比对愈伤组织进行诱导及再分化试验.结果表明:NMB培养基有利于愈伤组织的诱导;在诱导培养基中添加2,4-D 2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L能明显提高出愈率;再分化率最高的培养基配方为NMB+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,野生型和含Ac/Ds的突变体的种子表现一致.     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

水稻突变体库构建方法的新发展——CRISPR/Cas9系统

水稻是世界上重要的粮食作物之一.随着水稻全基因组测序的完成,迫切需要开展基因组功能的研究,其中突变体的获得是至关重要的环节.构建水稻突变体库是挖掘优异种质资源、分离并鉴定基因功能最直接的办法.概括了几种早期常用的突变体库构建方法,重点介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制突变体库的研究进展.     

油菜素内酯对拟南芥和水稻根毛发育的影响

油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是植物生长发育所必需的一类植物激素。本研究以拟南芥和水稻为研究对象,借助BR相关突变体,通过外源施加BR及BR合成抑制剂研究BR和根毛生长发育的关系。结果表明:在双子叶模式植物拟南芥中,BR抑制根毛的生长发育;在单子叶模式植物水稻中,BR对的根毛的发育存在剂量反应,在一定的浓度范围内促进根毛的生长发育。     

基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用

基因捕获是一种新的基因标签技术．被广泛应用于植物突变体库的构建及基因分离。近年来,基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展;介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

A single genetic unit specifies two transposition functions in the maize element activator

The self-mobile maize transposable element Ac (Activator) displays two trans-acting genetic functions: it induces transposition of the element Ds (Dissociation) but, as its dosage is increased, it also inhibits transposition. Previous work has shown that the 4563 base pair (bp)-long Ac element contains three open reading frames (ORF's) and that a deletion in ORF 1 in wx-m9(Ds), a Ds derivative from Ac isolated at the wx (waxy) locus, results in loss of transposition. The Ds element in the bronze allele bz-m2(DI) is shown to have arisen from Ac by a 1312-bp deletion that is located almost entirely within ORF 2 and does not affect ORF 1. The Ds elements in wx-m9(Ds) and bzm2(DI), defective in ORF 1 and ORF 2, respectively, do not complement genetically to restore the transposition function of Ac; therefore, this function must be specified jointly by ORF's 1 and 2. Furthermore, since bz-m2(DI) does not contribute to Ac's inhibitory dosage effect, both Ac properties result from the expression of the same genetic functional unit.     

Ca~(2+)对水稻Ac/Ds愈伤组织增殖·分化及生根的影响

[目的]研究Ca2+对水稻Ac/Ds愈伤组织增殖、分化及生根的影响。[方法]选用水稻品种Dongjin的Ac/Ds插入突变株系的种子,从成熟胚盾片诱导出愈伤组织,在筛选出的最适增殖、分化及生根培养基中添加不同浓度的Ca2+,研究Ca2+对水稻愈伤组织增殖、分化及生根的影响。[结果]适当增加Ca2+浓度能提高水稻愈伤组织的相对生长量、分化率、再生植株生根条数及根长,当Ca2+浓度为6.0mmol/L时效果最佳,当Ca2+浓度为7.5~15.0 mmol/L时水稻愈伤组织的相对生长量、分化率、再生植株的生根条数及根长呈下降趋势。[结论]适当增加培养基中Ca2+浓度可提高水稻Ac/Ds愈伤组织的相对生长量、分化率、再生植株生根条数及根长。     

两种拟南芥MYB51突变体的鉴定与初步分析

拟南芥MYB51(AT1G18570)转录因子是吲哚族芥子油苷合成的正向调控因子。研究组从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,Ohio State University,USA)购买AT1G18570的两种T-DNA插入突变体SALK_045103和SALK_059771,分别通过基因型分析筛选得到纯合突变体。半定量RT-PCR分析结果表明,两种突变体中MYB51基因的表达量极低。高效液相色谱检测结果表明,两种突变体中吲哚族芥子油苷含量与野生型相比均显著降低。由此可知,SALK_045103和SALK_059771突变体中MYB51转录因子的功能显著降低,为进一步探讨拟南芥MYB51转录因子在环境因子调控吲哚族芥子油苷合成过程中的作用奠定了材料基础。     

异三聚体G蛋白在IAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用

以拟南芥的野生型（ws）和异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体（gpa1-1,gpa1-2）和超表达突变体（wGα,cGα）为材料,通过施加不同浓度（0~0.8 mg/L）的IAA处理,对拟南芥根生长发育的一些形态指标进行了观测比较。结果表明：①随着培养基中IAA浓度的不断升高,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度IAA处理下,无明显差异;②IAA在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在相同浓度IAA诱导的侧根生长中,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少。初步证明,G蛋白不参与主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法

[目的]介绍一种适于拟南芥PCR检测的DNA快速提取方法。[方法]通过对常规DNA提取方法的改进,获得可以快速大批量地提取拟南芥DNA样品的方法,并以随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系为样品进行验证。[结果]经过琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收检测,DNA样品完整且污染少,PCR扩增目的片段结果良好,适于作为PCR反应的模板。经过对随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系的PCR检测,阳性植株目的基因扩增条带清晰,无假阳性,试验结果理想。[结论]该方法适用于拟南芥DNA样品的快速提取、PCR检测及拟南芥突变体筛选工作。     

一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法（摘要）（英文）

[目的]介绍一种适于拟南芥PCR检测的DNA快速提取方法。[方法]通过对常规DNA提取方法的改进（省去液氮研磨和苯酚提取的步骤）,获得可以快速大批量地提取拟南芥DNA样品的方法。于1.5ml Eppendorf管内加入400μl DNA提取液[内含200 mmol/LTri（pH值7.5）,25 mmol/LEDTA（pH值8.0）,250 mmol/LNaCl,0.5% SDS（W/V）],剪取拟南芥叶片材料少许（1片以下）加入400μl DNA提取液,用微型研磨棒将叶片捣碎至溶液成绿色,放置3 ～5 min;加入400μl氯仿/异戊醇（体积比24：1）,混合均匀,12 000 r/min离心5 min;取上清液至另一1.5 ml Eppendorf管内,加入300μl异丙醇,颠倒混合均匀,室温下放置5 min,12 000 r/min离心5 min;弃去上清液,以70%乙醇漂洗,放置晾干,加入100μl灭菌超纯水溶解,4℃放置备用。以随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系为样品进行验证。[结果]经过琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收检测,DNA样品完整且污染少,PCR扩增目的片段结果良好,适于作为PCR反应的模板。经过对随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系的PCR检测,阳性植株目的基因扩增条带清晰,无假阳性,试验结果理想。[结论]该方法适用于拟南芥DNA样品的快速提取、PCR检测及拟南芥突变体筛选工作。     

拟南芥中 Fibrillarin 基因的克隆.表达.纯化及与 ak6 蛋白相互作用研究

[目的]研究拟南芥中Fibdllarin基因的克隆、表达及纯化，并探索其与ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX-6P-1与Fibrilla—r流基因构建重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，运用同样方法构建PET-28a—ak6原核表达质粒，获得His—ak6融合蛋白，并运用体外pulldown技术验证二者的相互作用。f结果l在温度为37℃、诱导时间为16～20h、IPTG浓度为0．5mmol／L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。试验成功获得了符合标准的RNA，并获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带；pull—down试验结果表明，拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。[结论]拟南芥ak6突变体植株可能由于ak6的缺失影响了rRNA前体的加工，从而抑制核糖体的合成，进而阻碍拟南芥茎的生长，使植株表现明显的矮小症状。