Cloning and expression of phytoene synthase gene in Strelitzia reginae

[目的]揭示八氢番茄红素合成酶(PSY)基因在鹤望兰花色形成中的作用.[方法]依据植物PSY基因的氨基酸保守序列设计引物,从鹤望兰黄色花萼中克隆PSY片段,对该片段进行序列比对和系统进化分析,并应用RT-PCR技术分析PSY基因在不同器官和花朵发育过程中的表达特性.[结果]克隆获得248 bp的PSY段,编码82个氨基酸,经注册,在GenBank的登录号为JN887695.由该片段推导出的氨基酸序列与其他植物的PSY蛋白有很高的同源性,其中与大蒜的亲缘关系最近,达90％,初步证明为目标基因.此外,该基因在鹤望兰始花期和黄色萼片中表达量最高.[结论]PSY可能在转录水平上对鹤望兰黄色花的形成起调控作用.     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

辣椒八氢番茄红素合成酶鉴定、进化与表达分析

基于辣椒全基因组序列,对辣椒八氢番茄红素合成酶(PSY)基因家族进行鉴定、系统分析,并对其在果实不同发育阶段和不同组织的表达特性进行研究。结果表明,在辣椒基因组中鉴定出6个CaPSY基因,分布在4条染色体上,编码358～432个氨基酸。系统进化树分析结果表明,辣椒PSY基因与其他相关物种PSY基因分为2大类。通过MEME工具鉴定出辣椒PSY基因共有8个保守基序(motif1～motif8)。辣椒PSY实时定量检测结果表明,6个CaPSY基因在辣椒根、茎、叶、花和果实中均有表达,但表达量不同,呈现出组织特异性,推测这些基因在辣椒组织中有不同的功能。该研究结果可以为辣椒PSY基因进化关系、功能差异等进一步研究提供参考。     

21种植物八氢番茄红素合成酶的生物信息学分析

[目的]对番茄等21种植物的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)进行生物信息学分析,为研究植物八氢番茄红素合成酶的结构与功能分析奠定基础.[方法]采用Blast、ProtParam和SignalP等生物信息学软件,对番茄、拟南芥、辣椒和胡萝卜等21种植物PSY的理化性质、蛋白结构和系统发生树等进行分析.[结果]21种植物PSY氨基酸不存在信号肽,不具有跨膜结构,推测PSY可能定位于细胞质叶绿体中发挥功能,二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成.[结论]PSY蛋白为较不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位于叶绿体上.不经过跨膜转运,而是直接在细胞质基质中形成.     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。     

‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。     

君子兰八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登陆的黄水仙八氢番茄红素合成酶基因(登录号:X78814.1)设计特异引物,通过PCR扩增从君子兰cDNA中克隆出一个1.4 kb的片段。序列分析表明,这个序列全长1 395 bp,包含一个1 272 bp的开放阅读框,并且编码423个氨基酸。与水仙(DQ984674)、文心兰(FJ859988)和茶花(EF545005)相比,此cDNA序列显示出98%~76%的同源性,并且与水仙、猕猴桃、番茄和柿相比,其氨基酸序列显示出达到了99%~80%的同源性。由此可知,研究所克隆的序列为君子兰的PSY全长基因,该PSY基因已登陆GenBank(登录号:JF499694)。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

普通小球藻八氢番茄红素合成酶基因psy的cDNA克隆及生物信息学分析

通过RACE-PCR首次克隆获得了普通小球藻(Chlorella vulgaris)中八氢番茄红素合成酶编码基因psy 的cDNA全长序列.该序列全长1 605 bp,包括1 245 bp开放阅读框,编码415个氨基酸.氨基酸序列对比及系统发生分析表明其与其他物种的PSY蛋白具有同源性,与绿藻聚为一支,与小球藻(Chlorella variabilis)、原壳小球藻(Auxenochlorella protothecoides)和佐夫色绿藻(Chromnochloris zofingiensis的遗传距离最近(分别为0.173、0.188和0.239),并具有较高的相似性(81％ ～ 84％)和一致性(69％ ～ 76％).亚细胞定位预测表明普通小球藻PSY前45个氨基酸残基为叶绿体转运肽,可能引导翻译后的肽链进入叶绿体.保守区块、特征基序分析及三维建模显示,序列中具有多个潜在的蛋白质修饰位点,以及PSY蛋白的保守区块和特征基序,包括两个保守的底物-镁离子结合位点和两个活性位点遮蔽残基,用于结合底物及保护催化反应中间产物;普通小球藻PSY蛋白中还具有一个特异的底物-镁离子结合位点,其活性和功能还未知.总之,研究结果揭示了普通小球藻psy基因的cDNA全长序列及可能的蛋白质序列结构特性,结果可为构建过表达载体,提高类胡萝卜素产量提供相关信息.     

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因 S rD FR ,该片段长246 bp ,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明, SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰 S rD FR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量 PCR分析表明, S rD FR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。     

鹤望兰组织培养研究进展

鹤望兰为世界著名的多年生草本花卉,具极高的观赏价值和经济价值。笔者从外植体选择、植物生长调节剂与添加物的使用、培养基和培养条件的影响、褐化控制等方面,综述了国内外鹤望兰组织培养研究的进展,并就有关研究工作提出建议。     

鹤望兰2n配子诱导研究初报*

 以多年生开花鹤望兰植株为试验材料，采用不同浓度秋水仙素（0.05%,0.10%,0.20%）对鹤望兰处于减数分裂Ⅰ期的幼小花蕾进行诱导。结果表明：0.20%浓度的秋水仙素诱导效果最好。与对照相比，在形态学上，花瓣、萼片、柱头，花粉粒大小等变化较明显。细胞学上，配子出现了明显的加倍现象,并检测到导致2n花粉形成的异常减数分裂现象：（1）中期Ⅱ和后期Ⅱ的小孢子母细胞中发生异常的纺锤体定位，表现为平行、八字形、融合纺锤体；（2）末期Ⅱ4个子核呈两极分布，每极2核，或呈三极分布，其中一极2核，另两极单核；（3）四分体时期观察到了二分体、三分体情况。并且2n花粉频率的估测值（20.30%）与实测值（17.30%）相接近。因纺锤体定位异常而产生的2n配子在遗传上等同于FDR型，因而在有性多倍化育种中具有重要的利用价值。     

鹤望兰的自花与异花授粉研究

珍稀名贵花卉鹤望兰是典型的鸟媒植物，引种到我国栽培，由于没有蜂鸟，必须人工授粉才能结实.为了研究人工授粉的效果，提高鹤望兰的授粉成功几率，对授粉的时间、同一花序的不同花朵、自花、异花等进行比较试验.结果表明①在厦门地区，4～7月、9～11月进行人工授粉效果最好；②异花授粉的结果率明显高于自花授粉，异花授粉的结果率平均为91.75%，自花授粉仅为40.76%；③异花授粉的单果种子数为24.5个、自花授粉为10.4个，两者存在明显差异；④同一花序的各花朵间异花授粉结果率无差异，而进行自花授粉各花朵间存在明显差异；⑤同一花序的不同花朵间授粉结实的单果种子数无差异.     

鹤望兰优株评选的研究

对鹤望兰 1～ 3年生的苗期株高进行比较频次分布检验 ,正态分布最理想 .鹤望兰苗期优株评选时 ,以株高为因子确定优株的入选率为 :1年生的入选频率为 1.35 % ;2年生的入选频率为 1.85 % ;3年生的入选频率为2 1% .据此选出 1～ 3年生的候选优株 2 3株 ,并制定了鹤望兰 1～ 3年生的优株评选标准     

鹤望兰组织培养和快速繁殖的研究

[目的]建立以组织培养为基础的鹤望兰快速繁殖体系。[方法]研究了以鹤望兰成熟种子切段作为外植体的组织培养方法。以MS为基本培养基,通过改变激素的种类和浓度配比来选择合适的培养基,建立鹤望兰组培快繁体系。[结果]以成熟种子切段作为外植体,表面消毒以浓度70%酒精预处理30 s,再用浓度0.1%HgCl2浸泡10 min,效果较好;培养基MS＋6-BA1.5 mg/L＋ZT1.0 mg/L＋NAA1.0 mg/L有利于原球茎的诱导,适用于初代培养;MS＋6-BA2.0 mg/L＋ZT1.0 mg/L＋NAA0.5 mg/L有利于原球茎丛生芽的形成和增殖,可用于继代增殖;1/2 MS＋IBA0.6 mg/L适宜诱导生根获得再生植株,生根率达90%以上;生根苗移栽到添加适量腐叶土、粗砂的疏松肥沃的培养土中,成活率达92%以上。[结论]该研究结果为鹤望兰快速繁殖体系的建立提供了基础资料。     

鹤望兰新株系耐寒性鉴定

自主选育的鹤望兰新株系与普通栽培株系相比,在福州极端低温下(-2℃)表现为耐寒性。为进一步验证,通过不同梯度的人工低温处理(0、-2、-3、-4、-5、-6℃),测定2株系叶片相对电导率并配合logistic回归方程计算低温半致死温度(LT50)。结果表明,2个株系相对电导率随处理温度的降低均呈"S"型变化,在试验低温范围内,与温度间极显著负相关,且新株系低温半致死温度为-4.8℃,栽培株系低温半致死温度为-3.6℃,新株系的半致死温度高于栽培株,进一步证实新株系具有耐寒性。     

鹤望兰组织培养的褐变因素及防止措施

对不同外植体类型、大小以及不同培养基成分和状态对鹤望兰组培褐变的影响进行研究。结果表明:开花株和一年生苗褐变严重,种子切段和无菌播种苗的褐变较轻;外植体较大有利于减轻褐变;纸桥液体培养可以有效降低外植体的褐变度。