GNA基因遗传转化甘蔗研究

虫害常常给甘蔗生产造成重大损失。GNA对蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式害虫和某些咀嚼式害虫如蛴螬等具有极高的毒性。本研究对引进的GNA基因进行鉴定，并利用基因枪将其转化甘蔗愈伤组织，经筛选、分化，获得了一批抗性再生植株，抽样检测，获得了4株PCR阳性植株，为培育优良抗虫甘蔗新品种创造了条件。     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

甘蔗花青素转录因子基因ScRS克隆与基因枪转化研究

花青素不仅是天然色素,而且具有保健功能。花青素转录因子基因对于调控花青素的合成具有关键作用。本研究根据玉米花青素转录因子基因RS序列设计引物,利用同源克隆技术,得到甘蔗花青素转录因子基因ScRS的全长序列;在ScRS序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点,构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScRS,包被微粒载体通过基因枪对甘蔗愈伤组织进行轰击,转化的愈伤组织明显呈紫红色;将紫红色愈伤组织分化培养获得再生甘蔗植株,经PCR检测,获得转ScRS基因阳性植株,初步证实利用克隆的基因转化甘蔗可以使愈伤组织显色。研究结果对于建立新型的遗传转化可视化示踪体系和培育高花青素甘蔗品种具有重要意义。     

转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

利用已修饰的CpTI基因进行转基因检测,根据修饰后的目的基因片段序列对两个甘蔗品种(P44和福农94-0403)的转基因甘蔗进行RT-PCK检测研究,结果在被检测的10 株甘蔗中验证了3株已转入植株中,RT-PCR检测到的20、25、26号植株均呈阳性,证明被修饰的sck基因已成功转入甘蔗.     

甘露糖筛选系统的建立及在甘蔗转基因中的应用

用甘露糖作为筛选底物,对甘蔗品种福农95-1702外植体的再生进行研究,建立福农95-1702的甘露糖筛选体系;在甘蔗愈伤组织的继代、分化、生根三个阶段进行抗性筛选时,甘露糖占总糖的比例分别是60%、60%和30%。在以上筛选体系的基础上,将福农95-1702作为受体材料,通过基因枪轰击法,将含有cryIA(c)抗虫基因的基因表达盒与筛选标记基因(pmi)进行共转化,通过甘露糖筛选,最终获得26株抗性再生植株,经PCR检测,其中4株呈阳性。初步说明cryIA(c)基因已经整合到福农95-1702的基因组中,获得了4株转基因阳性甘蔗植株。     

通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因（cryIA)导入大豆，从发芽5-7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体，经农杆菌感染和共培养后，在选择培养基上4周左右出现抗性不定芽，将不定芽转移到芽伸长培养基上，4-6周后再生苗长至2.5-3cm高，再将再生苗切下转入生根培养基，2周左右生根，生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中，所有植株均能正常开花结英，在移栽成活的8株T0植株中有7株PCR检测呈阳性反应；在7个T1株系中有4个株系存在PCR阳性植株，取4个稳定遗传的T1代株系内的阳性植株的叶片提取DNA，用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析，结果4个株系均呈现阳性，证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。     

2种不同启动子驱动下1-SST基因转化甘蔗的抗旱性比较

将从菊芋中克隆到的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因(即1-SST基因),与根部特异性表达启动子pPST2a组合,通过农杆菌介导法获得转pPST2a:1-SST基因甘蔗植株,通过分子检测共得到15个阳性转基因株系。将前期工作得到的转rbcs:1-SST基因甘蔗5个株系与转pPST2a:1-SST基因甘蔗进行抗旱性比较。结果发现,转pPST2a:1-SST基因甘蔗的抗旱性高于转rbcs:1-SST基因甘蔗。与启动子rbcs相比,启动子pPST2a能够更大程度上增强转1-SST基因甘蔗植株的抗旱性。     

Bt基因导入马铃薯品种大西洋的研究

通过基因工程手段,利用农杆菌介导法,将Bt基因导入马铃薯品种大西洋,同时对马铃薯品种大西洋的叶片再生体系进行优化,探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的因素,确立了最佳植株再生体系和遗传转化条件,获得了转基因植株。     

农杆菌介导抗虫CpTI基因的花生遗传转化及转基因植株的再生

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导途径，将抗虫CpTI基因转入花生，经过诱导分化获得转基因再生植株。PCR检测及Southern杂交鉴定结果表明，外源CpTI基因已整合到大部分再生花组中。通过抗虫性检测试验，转基因花生具有一定的抗虫性。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

小麦5 10亚基基因转化研究

为了获得具有优质亚基基因的小麦转化植株，以豫麦18号和豫麦21号两个基因型的小麦幼胚为受体，利用基因枪法将重组质粒pCAMBIA1301-Sub5 10导入小麦幼胚，分别获得18株和20株再生植株，经PCR检测分别有7株和10株同时扩增到5亚基和10亚基的目标片段，初步表明外源目标基因已整合到小麦的基因组中。     

基于近等基因导入系发掘玉米抗甘蔗花叶病毒主效基因

利用玉米自交系掖478与中自01构建近等基因导入系群体(BC4F2),通过田间人工接种甘蔗花叶病毒鉴定获得抗病植株。采用38个SSR标记分析抗病株基因型,通过连锁不平衡分析,在玉米第3和6染色体上发掘3个主效抗病QTL。第3染色体上的QTL置信区间为26.1cM-phi053-5cM;第6染色体上的QTL置信区间分别为1.2cM-bnlg161和5.3cM-bnlg1538-7cM。建立了基于近等基因导入系发掘玉米抗甘蔗花叶病毒主效QTL技术,获得了一批含有抗病毒QTL的近等基因导入系,为抗病育种提供了信息和材料。     

利用基因枪法将Bt基因导入玉米优良自交系

利用基因枪法将Bt基因导入玉米优良自交系501和C111.轰击后的幼胚转至附加Bialaphos浓度为10 mg/L的选择培养基上进行愈伤组织的诱导,继代筛选3轮,每轮3周.得到的抗性愈伤组织在不含Bialaphos的分化培养基上进行绿苗分化,501获得了20株转化再生植株,C111获得了10株转化再生植株,PCR鉴定结果表明Bt基因已整合到玉米自交系501和C111的基因组中。     

基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报

将从灰树花（Grifola frondosa）中分离克隆到的海藻糖合酶cDNA以正向插入植物表达载体pBI121/BamHI Sst1位点，获得一植物表达载体pBT；又用Ubi-L启动子插入植物表达载体pBI121/HindⅢ＋Xbal位点，获得重组质粒pUB,再把海藻糖合酶cDNA正向插入pUB/BanHI SstI位点，获得另一植物表达载体pUBT。然后通过基因枪法分别用植物表达载体pBT和pUBT转化甘蔗。再生植株的点杂交和PCR－Southern杂交表明海藻糖合酶基因已整合进甘蔗的基因组中。     

几丁质酶基因转化甜菜的初步研究

本试验通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导法将菜豆几丁质酶基因导入甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ,Ｌ．）,再生植株经卡那霉素筛选后,进行ＰＣＲ分析,结果表明：再生植株的转化率为２７．３％,甜菜叶柄是转化的较好受体。     

甘蔗转HC-Pro基因的研究

通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。     

Ti质粒介导的B、t、k-δ内毒素蛋白基因转化大豆的初步研究

以Ｔｉ质粒为介导，将ｐＫＴ５４Ｂ７Ｃ５质粒上的Ｂ、ｔ、ｋ－δ内毒素蛋白基因导入东北大豆“黑农３７”、“黑农３９”等品种。采用多种外植体和感染方法，从胚轴和子叶节诱导出丛生芽与再生植株。经卡那霉素筛选和冠瘿碱检测，初步证明外源基因导入大豆基因组中。共获得８１株再生植株，其中成活３０株，仅３株结７个荚，得到７粒种子。ＰＣＲ检测和ＤＮＡ分子杂交，鉴定这７株再生植株呈阳性反应，证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。７粒种子均已萌发，植株生长发育正常     

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导，将抗真菌病的几丁质酶基因，导入默经江省栽培大豆一东农３７号，吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽，并再生植株，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测，经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中，有７株呈阳性反应，证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。     

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系

利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系18-599红、18-599白幼胚诱导的愈伤组织,转化的愈伤组织在Bialaphos浓度为8 mg/L、10 mgL、5 mg/L的筛选压下经过三次抗性筛选后,分别再生出可育植株12株和6株.PCR检测结果表明18-599红和18-599白分别有10株和3株为阳性,说明CP基因已导入到玉米自交系中。     

双价抗菌肽基因转化辣椒

在建立高效快速辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）子叶离体培养和植株再生体系的基础上,将昆虫抗菌肽Ｂ、Ｄ基因构建而成的双价质粒ｐＣＤＢ－Ⅱ以逐杆菌为介导转入５个辣椒栽培品种,共获得Ｋａｎ＾Ｒ植株１２００多株,对部分Ｋａｎ＾Ｒ植株进行点杂交、ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测,结果证明了外源基因被成功整合。盆栽接青枯菌试验,结果显示,转基因植株具有较强的抗病力。