水稻醇溶蛋白启动子驱动下的ipt芒基因表达及对烟草种子iPAs含量和种子重量的影响

将种子特异性表达的水稻醇溶蛋白启动子P与／pt基因融合，构建了pBI121-Pi植物表达载体，通过农杆菌LBA4404介导将基因整合到烟草的基因组中，利用抗生素筛选和PCR检测及序列分析，筛选出转基因的植株，成熟种子通过ELISA试剂盒检测其细胞分裂素含量，发现iPAs的含量为对照的4．17倍，种子的千粒重与对照相比增加了12．14％。     

生长素合成关键酶基因iaaM种子特异表达载体的构建及转基因油菜的获得

生长素是重要的植物激素,它对植物的生长发育具有重要的调控作用,它能诱导营养物质向其含量高的部位运输。通过转基因技术提高内源生长素在油菜种子中的含量,诱导营养物质向种子运输,为提高油菜灌浆速度,增加产量提供了新的研究方向。iaaM基因编码的色氨酸单加氧酶是催化色氨酸(Trp)转变为生长素(IAA)的关键酶,将iaaM基因与油菜(Brassica napusL.)种子发育早期特异性表达的储藏蛋白专一性启动子(Napin)融合并插入植物表达载体pCAMBIA3301中,构建iaaM基因的种子特异表达载体,并经农杆菌介导转化甘蓝型油菜。经PPT抗性筛选、GUS组织化学检测、PCR检测,初步证实外源基因已整合进油菜基因组,获得转基因植株。     

ipt基因种子特异表达载体的构建及转基因大豆的获得

细胞分裂素是重要的植物激素,它对植物的生长发育具有重要的调控作用。通过基因工程技术提高内源细胞分裂素在大豆种子中的含量,诱导营养物质向种子定向运输,可提高大豆的灌浆效率,为增加作物产量提供了新的研究方向。ipt基因编码的异戊烯转移酶是催化AMP转化为细胞分裂素的关键酶,将ipt基因与大豆种子发育中后期特异性表达的β-伴球蛋白α-亚基专一启动子(7ap)融合,构建了植物表达载体pCAMBIA33017αp-ipt-CaMV35 3'ULR,并通过农杆菌介导转化大豆。经草铵膦抗性筛选、PCR、GUS组织化学染色及Southern Blot检测,证实外源基因以单拷贝的形式整合进大豆基因组,共获得8株转基因大豆。     

印楝种子粗提物诱导烟草炭疽病抗性的生理效应

[目的]研究印楝诱抗烟草炭疽病的机理,为烟草炭疽病的生物防治提供理论依据.[方法]测定根施印楝种子粉末对烟草炭疽病的防效,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测印楝种子粉末处理后烟草的NTF6、NtLox、NtS-GT1、NtPAL、NtPDF、NPR1、NtRar1和PR1a等8个相关抗病基因的表达变化;对比叶面喷施不同印楝种子提取物(甲醇、乙酸乙酯和石油醚)溶液对烟草抗氧化酶活性的影响,并测定叶面喷施印楝种子甲醇提取物不同分离流分处理的烟叶总酚含量及抗炭疽病效果.[结果]根施印楝种子粉末可使烟草炭疽病的病情指数(26.67%)较对照(74.17%)显著降低(P<0.05,下同).qRT-PCR检测结果表明,NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等4个抗病基因的相对表达量与印楝诱导烟草抗炭疽病相关.印楝种子甲醇提取物对烟草抗氧化酶活性的影响最大,其丙酮流分段在处理后6和96 h诱导烟草的总酚含量较对照明显提高,分别为对照的2.52和3.34倍,且其诱导烟草抗炭疽病的能力最强,病情指数(25.00%)显著低于对照(69.17%).[结论]印楝种子提取物通过诱导提高PPO和POD抗病相关酶活性及诱导NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相关基因的表达产生抗炭疽病作用,且诱导活性成分主要存在于甲醇提取物的丙酮流分,其可作为烟草炭疽病的诱抗剂推广应用于烟草生产.     

利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代

转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良,其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节。本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库SGN-TEA搜索结果,克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因SlOLE1(Solyc06g034040)。利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因TagRFP的编码区序列插入到SlOLE1基因的终止密码子前,形成一个嵌合基因SlOLE1-TagRFP。将嵌合基因插入到pBI121双元载体,构建植物表达载体pSlOLE1-TagRFP,利用农杆菌介导法转化番茄品种‘Money Maker’,T₀代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光。PCR分子标记进一步验证发现,红色荧光种子萌发的幼苗均存在TagRFP序列,表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为100%。由此,本研究建立了一种利用SlOLE1-TagRFP嵌合基因,可以通过种子红色荧光可视化分析,简单快速、低成本地鉴定转基因番茄后代的方法。     

转高赖氨酸含量基因(Cflr)小麦植株的获得及种子中蛋白质和赖氨酸的含量分析

为了获得种子总蛋白和赖氨酸含量都提高的转基因小麦新种质,构建了高赖氨酸蛋白基因(Cflr)的植物表达载体pAHC25-Cflr,用基因枪法将其导入扬麦158,通过PCR、RT-PCR和半定量PCR对转基因小麦植株T0及T1代进行了检测,同时对种子总蛋白含量与结合态系赖氨酸含量进行了测定和分析。检测结果表明外源基因已稳定整合到转化植株T0和T1代基因组中,并在小麦不同转基因株系的T1代中获得了表达,但不同株系的表达丰度不同。在检测的12株转基因株系中,有11个株系籽粒蛋白质的含量与其受体品种有显著差异,其中有6个株系的增幅在10%以上,最高的增加了22.6%;有10个株系种子干重的结合态赖氨酸含量有明显提高,8个株系与受体品种的差异达极显著水平,最高的Y1-2增幅达39.5%;从种子的蛋白质赖氨酸含量来看,有9个株系较受体品种有显著提高,其中4个株系与受体品种的差异达极显著水平,增幅最高的Y1-12蛋白质中赖氨酸含量比受体品种提高了22.9%。     

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明：与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

农杆菌介导pta和sb401基因共转化水稻的研究

利用农杆菌介导法,将半夏凝集素(pta)基因和高赖氨酸蛋白(sb401)基因导入水稻中,经潮霉素抗性筛选,得到70株独立再生植株.通过PCR检测,从中筛选出18株转基因植株.对这些转基因植株当代进行Southern blotting分析表明:pta 基因和sb401基因已经共转化并整和到受体基因组中.对转基因植株后代的叶片进行RT-PCR分析表明:pta基因在转录水平上得到了有效的表达.测定10株T0转基因植株成熟种子的赖氨酸和总蛋白质量分数表明,与对照相比,赖氨酸和总蛋白的提高率分别为8.48%～35.34%和4.55%～32.74%,表明sb401基因在大部分转基因植株成熟种子中的蛋白质水平上得到了比较有效的表达.     

转基因油菜 W-4 fad2基因沉默的种子特异性分析

目的：]研究转基因油菜 W鄄4的种子fad2基因受 RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量 PCR法分析比较了转基因油菜 W鄄4与非转基因对照 Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的 fad2基因的相对表达量。[结果]对照 Westsr种子中 fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W鄄4种子中 fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照 westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜 W鄄4在种子发育过程中表达的 fad2基因的 dsRNA干扰了 fad2基因表达。W鄄4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示：W鄄4种子中油酸脱饱和指数（ODP）平均为0.07较 Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜 fad2基因表达下降的时期与 napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中 RNAi干扰 fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受 napin启动子的准确控制。     

棉花GhSEDEG38基因调控棉花耐盐性的功能分析

基于棉花体细胞胚胎再生不同时期表达谱中筛选出一系列差异表达转录因子,通过RT-PCR和qRT-PCR分析这些转录因子在不同逆境处理下的表达,发现GhSEDEG38基因(somatic embryogenesis differencially expressed gene 38)的表达受盐胁迫诱导明显上调;序列分析发现GhSEDEG38编码bZIP型转录因子,与拟南芥bZIP53基因同源。为进一步验证该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,通过分子检测获得了表达量显著降低的转基因棉花株系。通过对萌发期和三叶期转基因材料和对照材料进行盐处理发现,干涉GhSEDEG38基因降低棉花在萌发期及苗期对盐胁迫的抗性,盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料,而可溶性糖含量显著低于对照材料。综上,GhSEDEG38参与棉花对盐胁迫的应答。     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

茶树CsCBF1基因表达载体的构建及其转基因烟草的抗寒性分析

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】 利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0 ℃下处理48 h后,检测其膜质通透性、丙二醛（MDA）含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0 ℃处理3 d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25 ℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】 成功构建表达载体pBI121-CsCBF1,PCR、RT-PCR和GUS活性染色证明,CsCBF1已整合到烟草基因组中并转录表达。25 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草的膜质通透性、丙二醛含量和Fv/Fm均无显著差异,而在4和0 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型烟草的膜质通透性和丙二醛含量均显著低于转pBI121型和野生型烟草,但Fv/Fm显著高于转pBI121型和野生型烟草。生长恢复试验中,转pBI121-CsCBF1型的存活率为66.7％,而野生型仅为23.3％。【结论】 茶树CsCBF1基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,说明茶树CsCBF1基因存在于细胞抗寒的分子调控途径中,从而提高植物细胞的低温防御能力。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

过量表达紫茎泽兰类黄酮-3’羟化酶基因对转基因烟草POD、PAL活性的影响

紫茎泽兰具有强烈的化感作用,可抑制周围其他植物生长。类黄酮3’-羟化酶（F3’H）属于细胞色素P450（CYP）单加氧酶,具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能,在植物化感作用中行使一定的功能。利用转F3’H基因的烟草为实验材料,分别测定转F3’H基因植株、转pBI121空载体植株和野生型植株的过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,结果表明,转F3’H基因植株的POD活性分别是野生型植株和转空载体植株的3.8倍和2.0倍,而PAL活性则相应为4.0倍和2.0倍。由此推断F3’H基因在抵御伤害方面具有重要作用。     

将Pti5-VP16基因导入烟草的研究

以烟草叶片为外植体，通过根癌农杆菌叶盘转化法，将番茄Pti5-VP16基因导入烟草中。经卡那霉素筛选，获得了27株卡那霉素抗性植株，经PCR扩增和Southern杂交分析，证明抗性植株中整合了Pti5-VP16基因，表明所构建的含Pti5-VP16基因的植物表达载体pBI121UCH1具有正确的阅读框，并能在异源植物中表达。     

甜杨PsG6PDH基因超表达对提高烟草抗寒冻性的影响

【目的】研究甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(PsG6PDH)基因超表达对烟草抗寒冻性的影响,为烟草的抗寒冻育种提供理论依据。【方法】构建甜杨PsG6PDH基因的植物表达载体pBGⅠ,采用叶盘转化法转化烟草,对转化烟草植株低温驯化后的形态、生理生化指标进行测定与分析。【结果】PCR检测及Southern杂交结果显示,甜杨PsG6PDH基因已整合到转基因烟草的基因组中。低温试验表明,未经冷驯化的对照烟草较转基因烟草早出现萎蔫,恢复正常生长也较晚;经过冷驯化在接近0℃处理24h的对照烟草叶片基本萎蔫,而转基因烟草仍然正常。在0℃及更低温度胁迫下,转基因烟草的相对电导率一直保持在35%左右,而对照烟草的相对电导率则从35%上升到90%;随着胁迫时间的延长,转基因烟草的SOD、POD活性升高,而MDA含量下降。【结论】甜杨PsG6PDH基因能够提高植物的抗寒冻性,可以作为改良植物抗寒冻性的新的外源基因。     

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。