发根农杆菌介导西瓜转基因过表达体系的建立

【目的】建立发根农杆菌介导的西瓜转基因不定根过表达体系。【方法】探索利用野生型发根农杆菌K599侵染西瓜材料'Sugar Baby',诱导西瓜产生不定根的实验方法。借助该方法,将含有GUS基因和EGFP基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌K599,侵染西瓜材料'Sugar Baby',通过常规PCR、qRTPCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测,评价该过表达体系的效果。【结果】利用野生型和导入外源质粒的发根农杆菌均能成功诱导西瓜'Sugar Baby'产生不定根。PCR检测结果显示,携带pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper载体的发根农杆菌K599诱导产生的不定根阳性率达到100%。qRT-PCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测均能成功检测到GUS基因和EGFP基因的过量表达。【结论】利用发根农杆菌K599诱导西瓜产生不定根介导基因过表达的方法,具有周期短,操作方便,转化率高的特点,可实现基因功能的快速验证,为西瓜根系相关基因的功能研究提供技术支持。     

发根农杆菌K599对菊花活体转化及其高效再生

 发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。     

农杆菌介导的厚皮甜瓜遗传转化体系的建立

【目的】遗传转化是进行基因功能验证的重要手段,构建较为完善、高效的厚皮甜瓜遗传转化体系,为基因功能验证和厚皮甜瓜种质改良提供技术支撑。【方法】以厚皮甜瓜B8为材料,用携带植物双元表达载体p QY002005的根癌农杆菌介导转化B8子叶诱导再生,通过探究影响甜瓜遗传转化过程中的重要因子的作用,建立以B8为基础的甜瓜遗传转化体系。【结果】以正常光周期培养3 d的无菌苗子叶节为外植体,对其进行微刷+10 s超声处理可提高农杆菌侵染效率,荧光芽获得率达29.6%;压力85 kPa的2次5 min的抽真空侵染方式(间隔1 min)侵染效果较佳;4 mg·L^-1的Basta较适宜筛选抗性植株。利用以上方法,单次转化120个子叶节外植体,可获得31个再生荧光芽,17株生根苗,通过PCR检测确定8株阳性苗,阳性率达58.8%,阳性植株获得率为6.7%。【结论】成功建立了以B8为材料的甜瓜高效遗传转化体系,为甜瓜关键基因功能验证和种质精准改良提供技术支持。     

黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系,可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料,从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面,研究发根农杆菌菌株K599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明,75%(φ)的乙醇先处理种子30 s,再用5%的次氯酸钠灭菌5~10 min的种子消毒方法,农杆菌菌液OD_(600)值在1.2左右时进行侵染,共培养2天,是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实,经这样诱导出的黄瓜毛状根中,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

非组培依赖的发根农杆菌介导的薄壳山核桃转化体系构建

[目的]建立一种简单高效的农杆菌介导薄壳山核桃Caryaill inoinensis的转化体系.[方法]以薄壳山核桃钟山的幼苗为材料,采用四因素(菌种、菌液浓度、处理部位、苗龄)三水平正交试验进行农杆菌侵染薄壳山核桃茎部诱导发根,并通过DNA检测及GFP荧光验证.[结果]影响发根农杆菌侵染薄壳山核桃生根诱导率的因素大小...     

提高农杆菌介导番茄遗传转化效率的研究

利用农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,比较了不同的农杆菌种类、农杆菌侵染时间、外植体种类及番茄品种对农杆菌侵染效率的影响.转化后得到的再生植株,利用PCR、Southern杂交检测GUS基因是否整和进入基因组.结果表明:农杆菌介导法成功介导了GUS基因导入番茄.农杆菌EHA105侵染番茄的效率明显高于LBA4404,侵染时间3 min较好.子叶外植体的转化明显优于下胚轴,黄色串珠樱桃番茄的遗传转化效率高于中蔬5号;优化的转化条件可以使番茄获得较高的遗传转化效率.     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

农杆菌介导的黑果枸杞遗传转化体系的建立

以黑果枸杞下胚轴为试材,采用农杆菌浸泡侵染法,建立简单有效的黑果枸杞遗传转化体系,以期为深入研究黑果枸杞基因功能提供参考依据。结果表明:成功构建pORE R1-35S:GUS:NOS质粒载体,并通过冻融法导入农杆菌GV3101。调整菌液浓度至OD_(600)=0.5,侵染黑果枸杞下胚轴,经选择培养基筛选、PCR及GUS检测后,获得转基因阳性植株,转化阳性率为16%,通过驯化移栽后转基因植株均可成活。表明可通过农杆菌GV3101侵染黑果枸杞下胚轴实现外源基因的转化,且转化率较高。     

根癌农杆菌介导的‘魏可’葡萄遗传转化体系的优化

以‘魏可’葡萄离体叶片为外植体,利用植物表达载体上含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIA2301)对影响‘魏可’葡萄遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,最佳农杆菌介导‘魏可’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,卡那霉素质量浓度5 mg·L-1,羧苄青霉素质量浓度200 mg·L-1。采用此体系对‘魏可’葡萄进行转化,共获得9株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法检测,结果表明,有4株通过了PCR检测,1株通过了RT-PCR检测,初步证明nptⅡ基因已经整合进入‘魏可’葡萄基因组中。将PCR产物回收,经测序验证nptⅡ基因完全整合进入‘魏可’葡萄基因组中。对CK及经PCR检测呈阳性的株系进行卡那霉素抗性鉴定,发现PCR呈阳性的株系均比CK抗Kan的能力明显增强。