马立克氏病病毒gB基因的克隆及理组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒（MDV）2.8kbgB基因，并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ位点。然后用PstⅠ/NotⅠ酶切回收gB片段，插入到转移载体pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ/NotⅠ酶切位点处，构建了转移质粒pEFgpt12s-gB。将该质粒与鸡痘病毒（FPV）野毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过MXHAT选择培养基进行筛选，蚀斑纯化，经PCR扩增证实重组病毒中含有gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别，病毒效价分别为10^-5.43TCDID50/mL和10^-6TCID50/mL，表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。     

鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制 ,具有广阔的应用前景     

地高辛标记探针检测重组鸡痘病毒中的MDVgB基因

以XbaI从pVLgB中切下gB基因片段，用dig试剂盒通过六聚核苷酸随机引物合成DNA探针，对粗提的重组FPV、MDVGA、FPV282E4和CEFDNA以及pFGB1175质粒DNA进行打点杂交（Dot－blot）。经免疫学测定、NBT显色后发现，重组FPV、MDVGA、pFGB1175斑点呈明显阳性反应；而FPV282E4和CEFDNA则呈阴性反应．从而在DNA水平上证实了重组FPV基因组中gB基因的存在。     

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。     

表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体的构建

根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。     

山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株表达载体的构建

PCR扩增山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK（Thymidine kinase）基因作为侧翼序列;用XhoⅠ/NotⅠ消化含有报告基因的质粒pLSEG得到痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）p7.5启动子调控大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（E.coli.gpt）作为报告基因;人工合成VV I1L启动子用于调控表达外源基因,用Overlap PCR的方法将VV I1L启动子和VV p7.5启动子调控的gpt连接但使两启动子转录方向相背,并在VV I1L启动子下游引入XhoⅠ位点作为外源基因的插入位点,构建成表达载体元件I1L-P7.5-GPT。将I1L-P7.5-GPT插入TK基因的Acc65Ⅰ位点,构建成表达载体。将构建的载体转染山羊痘病毒G14-STV44-55株感染的羔羊睾丸细胞,用含有霉酚酸（Mycophenolic acid,MPA）等筛选试剂的培养基筛选重组山羊痘病毒（rGTPV）。结果显示,构建成以TK基因为侧翼、以VV I1L启动子调控目的基因,以gpt为报告基因的表达载体pGEM-TK-I1L-GPT,成功筛选到表达gpt的rGTPV,rGTPV至少可稳定传代15代。结果表明,构建了我国山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株的表达载体;TK基因是GTPV G14-STV44-55疫苗株的复制非必需区,以TK基因为插入位点获得的重组病毒可稳定传代15代以上。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因主要抗原表位区在大肠埃希氏菌中的高效表达及纯化

利用PCR技术扩增编码水疱性口炎病毒印第安纳型（VSV—Ind）糖蛋白基因的主要抗原表位区，通过引入其两端的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，定向插入到pET30c质粒T7启动子下游的多克隆区，构建重组质粒pET30c—vsvG，并转化至宿主菌BL21（DE3）株中。用1mmol／LIPTG诱导后，SDS—PAGE电泳表明，重组蛋白在大肠埃希氏菌中得到了高效表达，经过4h表达即可达到高峰；融合蛋白的相对分子质量为57ku。重组蛋白含有六聚组氨酸尾，主要以包涵体形式存在，Ni柱纯化后的蛋白经Western—blotting鉴定，具有良好的抗原性和特异性。     

利用BrdU在CEF（TK^＋）细胞中筛选TK^—重组鸡痘病毒

将新城疫病毒（NDV）四平株HN基因，插入不含报告基因，以TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA-2中的复合启动子下游，获得重组表达质粒pUTA-2HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒（FPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），培养、收获病毒后，用含40mg/L5－溴－2－脱氧尿嘧啶（BrdU)的培养液，在CEF（TK^ )细胞中筛选培养2代，然后用不含BrdU的培养液进行病毒蚀斑纯,化成功筛选出表达NDV HN蛋白的TK^-重组鸡痘病毒。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

肉种禽网状内皮增生症、鸡传染性贫血和禽白血病血清学调查

对不同种鸡场不同周龄肉种鸡进行REV、CAV和ALV（A、B亚群）抗体检测。在572份血清样品中，除了一个8．1周龄和15周龄鸡群CAV抗体阳性率分别为13．3％和75％外，其它鸡群无论是否进行CAV疫苗免疫，抗体阳性率均为100％。在212份血清样品中，REV抗体阳性率在16．7％～62．5％之间；ALV（A、B亚群）抗体阳性率在0％～75％之间。本研究结果表明，所检测种鸡群中存在3种免疫抑制性病毒的感染或混合感染。     

Investigation and Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus,Transmissible Gastroenteritis Virus and Pseudorabies Virus of Swine Diarrhea Cases in Shandong Province

To understand porcine viral diarrhea prevalence in the large-scale pig farms of Shandong province, a total of 3 035 clinical samples were detected by PCR from January, 2014 to December, 2016.Those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and pseudorabies virus (PRV). The results showed that the detection rate of PEDV, PRV and TGEV were 67.49%, 9.33% and 3.29%, respectively.During the past three years, the lowest detection rate of PEDV was 48.15% in the fourth quarter of 2014,and the highest was 88.57% in the fourth quarter of 2015.In 2016,the detection rate represented fluctuate declining compared with 2015.The highest positive rate of TGEV was 18.52% in the fourth quarter of 2014,and in the third quarter of 2015 was 15.38%.The lowest positive rate of TGEV was 6.67% in the first quarter of 2016 and TGEV was not detected in the other quarters. The highest detection rate of RPV was 15.68% in the second quarter of 2016,and the lowest was 2.56% in the second quarter of 2014,except the first quarter of 2014 that the PRV was 0. By detecting three kinds of viruses in 69 clinical samples collected passively, the results showed that the detection rate of PEDV,TGEV and PRV were 86.96%,5.80% and 37.68%,respectively. The total single infection rate was 69.57%,the single infection rates of PEDV,TGEV and PRV were 57.97%,1.45% and 10.14%, respectively;The total mixed infection rate was 30.43%,the mixed infection rates of PEDV/PRV,PEDV/TGEV and TGEV/PRV were 26.09%,2.90% and 1.45%, respectively;Obviously, the total single infection rate was higher than the total mixed infection rate. The results showed that the PEDV, PRV and TGEV were prevailing in Shandong province. There were PEDV/TGEV, TGEV/PRV, PEDV/PRV mixed infection, and the number of PEDV/PRV mixed infection was in the majority. However, there was no PEDV/PRV/TGEV mixed type infection. At present, PEDV was the major pathogen of porcine viral diarrhea and the test results could provide the reference to the diagnosis of porcine viral diarrhea.     

山东省猪腹泻病例中PEDV、TGEV和PRV的感染调查与分析

为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料（共3 035份）进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。     

禽网状内皮组织增生病病毒和马立克氏病病毒共感染对鸡的致肿瘤作用

用禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和马立克氏病病毒(MDV)共感染肉鸡，研究这2种病毒对鸡的致瘤作用，结果表明肉鸡共感染MDV和REV后13d即可发生死亡．接种后100d死亡率达84％。死亡鸡的肝脏、脾脏、肾脏和心脏等可以形成2种外观明显不同的散在的大肿瘤结节和弥漫性的小肿瘤结节。取发病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏和腺胃等组织样品做连续石蜡切片，HE染色后发现这些脏器均存在2种不同类型的肿瘤细胞增生。对这些连续切片分别用MDV和REV的单克隆抗体进行间接荧光试验，则同1份样品存在可以与REV和MDV分别呈现阳性反应的肿瘤细胞团，结果表明REV和MDV可以在感染鸡的体内分别诱发形成肿瘤。在接种后14、21、28和42d随机采集3只鸡的全血分离MDV和REV，均可以同时分离到MDV和REV。表明REV和MDV的共感染延长了病毒血症的时间。     

嵌合口蹄疫病毒抗原表位的重组塞内卡病毒A的构建及其鉴定

塞内卡病毒A（SVA）与口蹄疫病毒（FMDV）引起猪的临床症状难以区分,并且以SVA作为载体插入FMDV抗原表位外源基因的研究,目前还没有报道。为了构建一种嵌合FMDV抗原表位的重组SVA毒株并进行鉴定,本研究利用基因克隆技术将O型FMDV的B细胞表位与白蛋白信号肽（human albumin signal peptide,HAS）基因串联插入到SVA基因组中,成功构建了重组质粒,转染细胞后拯救出重组病毒rSVA-HAS-OB。结果显示：RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;细胞间接免疫荧光和Western blot鉴定了嵌合抗原蛋白的有效表达;遗传稳定性分析表明重组病毒在25代次的传代过程中仍稳定存在B细胞表位;病毒蚀斑表型和一步生长曲线结果表明,重组病毒与亲本毒株具有相似的增殖特性。本研究成功构建并拯救出能够表达FMDV抗原表位的重组SVA毒株,为以SVA为基础的嵌合病毒及疫苗的研究提供了理论和实验基础。     

山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。