Construction and Characterization of a cDNA Library from the Pulp of Coconut （Cocos nucifera L.）

To investigate the gene expression profile of endosperm development, a cDNA library was constructed and characterized from the pulp of coconut at different developmental stages. The constructed cDNA library incorporated approximately 1 × 10^7 clones in total, and the size of the insertion fragments ranged from 800 to 2 000 bp. Sequencing results of 100 randomly picked clones showed that the recombination rate was 96%. In subsequent sequence analysis, 41 clones （41%） were homologous to known function proteins, and 23 clones showed high amino acid identity （more than 80%） with the corresponding genes of different plants. Semi-quantitative RT-PCR indicated that oleosin and globulin genes are pulpspecific expression, and have differential expression level in different developmental stage. Clone 29, recognized as homologous to KIAA1239 protein （Homo sapiens）, was observed to occur nine times, indicating that this gene may be over-expressed during the endosperm development stage. However, the homologous protein was found only in mammals, and the detailed function is still unknown. Elucidation of the functional characterization of these genes will be carried out immediately.     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8．50×10^6 CFU,重组率在95％左右,插入片断大小为0．5～4．0kb,多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多（27．03％）,与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。     

水杨酸诱导云烟85基因表达差减文库的构建及初步分析*

 利用水杨酸（SA）诱导烟草抗病相关基因表达,以此为目标样本,以清水喷施为对照样本,进行抑制差减杂交,构建烟草抗病基因表达文库。结果显示,插入片段主要集中在150～500bp之间。随机挑选12个克隆进行测序,结果有7条与已知的系统获得性抗病基因同源,1条与病程相关蛋白PR1a同源,1条与光系统II的促氧蛋白一个亚基有较高同源性,1条与水通道蛋白基因（aquaporin 1）同源, 1条与Ert13基因有关,1条未找到同源序列,是新的cDNA片段。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定

 【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。     

Generation and Analysis of Expressed Sequence Tags （ESTs） from Muscle Full-Length cDNA Library of Wujin Pig

Porcine skeletal muscle genes play a major role in determining muscle growth and meat quality. Construction of a full-length cDNA library is an effective way to understand the expression of functional genes in muscle tissues. In addition, novel genes for further research could be identified in the library. In this study, we constructed a full-length cDNA library from porcine muscle tissue. The estimated average size of the cDNA inserts was 1 076 bp, and the cDNA fullness ratio was 86.2%. A total of 1 058 unique sequences with 342 contigs （32.3%） and 716 singleton （67.7%） expressed sequence tags （EST） were obtained by clustering and assembling. Meanwhile, 826 （78.1%） ESTs were categorized as known genes, and 232 （21.9%） ESTs were categorized as unknown genes. 65 novel porcine genes that exhibit no identity in the TIGR gene index of Sus scrofa and 124 full-length sequences with unknown functions were deposited in the dbEST division of GenBank （accession numbers： EU650784-EU650788, GE843306, GH228978-GH229100）. The abundantly expressed genes in porcine muscle tissue were related to muscle fiber development, energy metabolism and protein synthesis. Gene ontology analysis showed that sequences expressed in porcine muscle tissue contained a high percentage of binding activity, catalytic activity, structural molecule activity and motor activity, which involved mainly in metabolic, cellular and developmental process, distributed mainly in intracellular region. The sequence data generated in this study would provide valuable information for identifying porcine genes expressed in muscle tissue and help to advance the study on the structure and function of genes in pigs.     

细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

花生球蛋白基因克隆及其表达分析

利用噬菌斑原位杂交技术从花生未成熟种子cDNA文库中筛选到一个花生种子贮藏蛋白基因全长cDNA,该cDNA包含一个1 886 bp的开放阅读框,可编码536个氨基酸残基,Northern分析发现,该基因在种子发育早期开始表达,在之后的各个时期表达水平均较高。     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

新疆雪莲全长cDNA文库构建及表达序列标签(ESTs)特性分析

以野生新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kit)为研究材料,利用Creator SMARTTM cDNA Library Construction技术构建了雪莲全长cDNA文库,从野生雪莲中提取总RNA和mRNA , 用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链.通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA .将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上, 并对噬菌体进行包装,建成cDNA的全长库.经大肠杆菌XL1-Blue平板检测,原始文库滴度达4.03×107(pfu/mL).随机挑选500个克隆进行序列测定,PCR鉴定结果显示多数插入片段均在500 bp以上.将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,共有56个序列为非冗余数据.其中有14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,42个片段与已报道的基因有较高的同源性.这些EST数据为进一步筛选和克隆雪莲特异性表达基因提供了材料平台,为雪莲基因组数据增补了大量信息.     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。