沟叶结缕草遗传转化体系的建立

为构建有效的沟叶结缕草遗传转化体系,以沟叶结缕草愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将笔者单位克隆的耐盐相关基因ZmPDI基因转入野生型植株中,研究共培养时间、侵染液浓度、侵染时间和抗生素浓度等因子对转化效率的影响。结果表明：最佳遗传转化体系为菌株OD₆₀₀值为0.4,侵染30 min,共培养3 d后进行选择培养。特美汀在选择培养阶段最适抑菌浓度为250 mg/L,潮霉素愈伤组织筛选的最适选择压力为40 mg/L,苗筛的最适浓度为15 mg/L。通过GUS活性的组织化学分析和PCR鉴定,显示目的基因已成功转入沟叶结缕草基因组中。     

农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系的构建

宁麦13是目前生产中应用面积较大的弱筋小麦品种,以此品种建立农杆菌介导的成熟胚遗传转化体系有助于对该品种的个别性状进行针对性改良。本研究利用分别携带不同质粒pCXK1301和pAt-MYB12u的农杆菌株系GV3101对宁麦13成熟胚愈伤组织进行转化,通过对预培养时间、共培养时间和干燥处理等参数的研究,建立了农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系。宁麦13成熟胚转化体系的条件为:利用预培养6d的宁麦13成熟胚愈伤组织作为转化受体,使用含pAtMYB12u质粒的农杆菌株系GV3101,侵染菌液浓度OD600=0.6,侵染时间60min,采用干燥共培养4～5d(23℃,暗培养),诱导恢复培养10d,分化培养每4week继代一次,分化培养8week(12h光周期,25℃,2 000lx)。试验侵染2 600个宁麦13愈伤组织,获得127株再生植株,经分子检测,其中9株证实为阳性转化植株。     

根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究

为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

农杆菌介导短柄草遗传转化体系的建立

为了探索短柄草的遗传转化体系,以二倍体短柄草ABR 6为受体材料,通过对诱导培养基类型、潮霉素筛选浓度和根癌农杆菌侵染浓度等参数的优化,建立了农杆菌介导短柄草遗传转化体系。结果表明,来源于未成熟胚的胚性愈伤组织在LS培养基上诱导率最高,达76.27%,最佳Hpt筛选浓度为40 mg·L^-1,最佳农杆菌侵染浓度为OD₆₀₀=0.6,在此条件下ABR 6的转化效率可达5%;通过PCR检测12株抗性植株,发现7株能扩增出Hpt基因（845 bp）条带;通过荧光显微镜观察转基因植株叶片,发现绿色荧光蛋白的表达,进一步证实了转基因植株的可靠性。     

利用玉米萌动胚转化体系获得抗除草剂转基因新材料

以玉米杂交种郑单958为受体材料, 建立农杆菌介导的玉米萌动胚转化体系, 并获得抗除草剂转基因玉米材料。经过对农杆菌菌液浓度、共培养时间、乙酰丁香酮的浓度的优化, 农杆菌介导的玉米萌动胚转化法的最优参数为菌液浓度OD₆₀₀值为0.8, 共培养时间为48 h, 乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L。获得69株PCR阳性植株, 其中54株为bar基因金标免疫试纸条检测阳性植株, 29株获得种子;T1代植株具有草丁膦抗性, 并显示出胶体金免疫酶联反应阳性, 表明目的基因已整合玉米基因组内并有效表达, 而且能够稳定遗传给后代。     

农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析

为解决农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化效率较低的难题,以春小麦Bobwhite成熟胚为外植体,分析植物激素、愈伤组织预培养时间、侵染时间和共培养阶段干燥处理对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的影响,并在遗传转化处理中辅以3个组织再生相关基因(TaSERK1、TaSERK2、TaNiR)的qRT-PCR分析。结果表明,愈伤组织预培养阶段添加适量的2,4-D和Picloram均可诱导成熟胚愈伤组织的形成,但是2mg·L~(-1)Picloram培养基中愈伤组织的胚萌发率为20.78%,远高于2,4-D诱导的胚萌发率(11.38%);共培养阶段对农杆菌侵染的愈伤组织进行干燥处理能适当提高愈伤组织的转化效率;qRT-PCR分析发现再生相关基因TaNiR相对表达量的增加能适当提高愈伤组织的转化率。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

根癌农杆菌介导的高粱遗传转化体系的建立

用高粱幼穗诱导的愈伤组织与农杆菌共培养,成功地实现了农杆菌介导的高粱遗传转化,并筛选得到了转基因再生植株.经过PCR和Southern杂交,均已证实了外援基因已导入和整合到植物体中.得到的部分转基因植株,经过抗虫鉴定表明,具有很强的抗虫性.高粱遗传转化过程中最佳预培养时间是3～5 d,最适宜的菌液浓度为OD600值＝0.5～0.7,共培养培养基的最佳pH值是5.2～5.6,最佳温度为22～25 ℃,最佳共培养时间是3 d.100 μmol/L乙酰丁香酮对提高高粱愈伤组织遗传转化有非常显著的效果.     

根癌农杆菌介导的水稻转化体系

简要回顾了水稻转基因发展的历程;通过农杆菌介导法转化水稻的流程,分析了几种根癌农杆菌介导的目的基因转化水稻的影响因素:农杆菌菌系及Vir基因的活化、水稻基因型和培养基种类、农杆菌侵染外植体的时间、共培养的方式、共培养时间、选择标记与报告基因的选择、选择压;最后提出了水稻遗传转化中存在的问题及解决的方法。     

Establishment of Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation System for Rice Sheath Blight Pathogen Rhizoctonia solani AG-1IA

To construct the T-DNA insertional mutagenesis transformation system for rice sheath blight pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA,the virulent isolate GD118 of this pathogen was selected as an initial isolate for transformation.The conditions for transformation of isolate GD118 were optimized in five aspects,i.e.pre-induction time,co-culture time,acetosyringone(AS) concentration at the co-culture phase,co-culture temperature and pH value of induction solid medium(ISM) at the co-culture phase.Finally,a system ...     

根癌农杆菌介导茶树转化研究

通过检测GUS瞬间表达 ,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在 3 0mg/L左右 ,因而对以Kan为筛选标记的载体来说 ,5 0mg/LKan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD6 0 0 为 0 5 - 0 8的LBA4 4 0 4侵染 10分钟左右 ,暗中2 8℃共培养 2 - 3天。硝酸银对农杆菌生长有抑制作用 ,不宜在共培养阶段添加     

BADH基因转化水稻的方法比较

应用基因枪法与农杆菌介导法将来源于山菠菜的BADH（betaine aldehyde dehydrogenase）基因导入水稻。从获得转基因植株数量、转化率、转化植株PCR阳性率、外源基因拷贝数及其表达活性、T0代植株的结实率对两种转化方法进行了比较。结果表明,用农杆菌介导法转化BADH基因的转化效率和PCR阳性率比基因枪法更高,且用农杆菌介导法得到的转基因植株T0的结实率等农艺性状也优于基因枪法。     

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。     

GDS-80手持基因枪在橡胶树遗传转化上应用的参数优化与配件改进

GDS-80手持基因枪是美国Wealtec公司2009年推出的基因传递系统,具有操作简便、高效的特点。已报道的橡胶树基因枪转化研究都是使用台式基因枪。本文首先利用考马斯亮蓝轰击滤纸去除明显不适合的参数,接着以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,轰击巴西橡胶树体细胞胚以及愈伤组织,用荧光显微镜观察绿色荧光,探究适合橡胶树的轰击参数。而且比较了Image J软件和肉眼统计荧光斑点数及GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪的差异。结果表明：对于橡胶树体细胞胚和愈伤组织,仅依靠原厂配件难以获得较好的转化效果。本文设计了直径3 cm（与轰击范围相同）,高度2.5 cm,孔径60目的过滤网。同时改进装试验材料的培养皿,用刀片在培养皿的中心割出一个直径3 cm的圆圈,轰击胚状体时,将上述设计的过滤筛网正向卡在圆圈上,胚状体放入过滤网中,轰击时将培养皿用试管架架高,压力就从筛网及底部的空洞分解,微弹完全轰击到试验材料。轰击胚状体最优参数为：轰击压力为60 psi,针状调节阀为3圈,目标间隔盘为6 cm。轰击愈伤时将材料放到普通培养皿中心的轰击范围内,反向盖上过滤筛网。最优轰击参数为：轰击压力为50 psi,针状调节阀为4圈,目标间隔盘为6 cm。本文采用Image J软件进行荧光斑点计数,准确率与肉眼相当,但较肉眼省时。GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪转化效率相当,但GDS-80手持基因枪每打一枪比PDS-1000/He台式基因枪快12 min。研究结果为橡胶树遗传转化提供了高效的基因枪转化体系,为转基因研究提供了一个高效的统计荧光数的软件。     

根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化

选取含有氯嘧磺隆抗性标记的ILV1基因和报告基因GFP二元载体的农杆菌AGL-1,采用单因子和双因子方法研究根癌农杆菌AGL-1介导柱花草炭疽菌CH008转化过程中各主要因素对转化率的影响,优化构建ATMT转化柱花草胶孢炭疽菌体系条件,使转化效率达到300 ～400个转化子/106个炭疽孢子,即根癌农杆菌AGL-1浓度OD600=0.8,炭疽菌分生孢子浓度为1x106个/mL,AS浓度为100 μmol/L,诱导时间为6h,共培养温度和时间分别为25 ℃和4d.经PCR检测都有GFP片段,并能够表达绿色荧光蛋白.这为进一步开展炭疽菌对柱花草的致病机理研究提供了依据,优化转化体系有利于后续突变体库的扩大、筛选突变体和致病功能基因的研究.     

无机焦磷酸化酶基因的克隆与植物表达载体的构建

提取面包酵母基因组DNA,用无机焦磷酸化酶(PPase)基因特异引物通过PCR扩增出864bp的片段,并将该片段克隆至pMD18-T上。序列分析结果表明,该克隆序列与GeneBank上的PPase基因序列同源性达到100%。进一步将叶肉细胞特异性启动子rbcS和PPase基因克隆至植物表达载体pCBI上,构建了由rbcS启动子调控的PPase基因植物表达载体pCBIPR。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,为农杆菌介导的PPase基因对植物的遗传转化奠定基础。