金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究

金龟子绿僵菌属于真菌类生物杀虫剂,本文研究了接种量、种龄、菌种代数等生物因素对金龟子绿缰菌生长及产孢量的影响,并对液—固两步发酵工艺进行了研究。经过优化,得到金龟子绿僵菌产孢的最佳生物参数是:接种量为2.5g/100g、种龄为5-6天;采用固体二代种,培养6天,孢子产量可达1.531×10~(10)孢子/g干培养基。     

不同浓度增效剂对金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和球孢白僵菌产孢的影响

生防菌作为一种重要的生物杀虫剂,被开发成多种制剂应用于农林害虫的防治;微生物制剂的生产成本高、耗时长,极大影响其生产效率。本试验通过液固两相发酵法筛选出提高金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride和球孢白僵菌Beauveria bassiana产孢量的最优增效剂浓度。结果表明0.1%浓度增效剂对金龟子绿僵菌的促产孢作用达最大化,浓度达4.48×10⁹孢子/g;黄绿绿僵菌的最适增效剂浓度为0.05%,浓度达2.75×10⁹孢子/g;当增效剂浓度小于0.1%时利于黄绿绿僵菌的产孢,增效剂高于0.1%时抑制产孢;而球孢白僵菌的产孢量与增效剂浓度正相关,最大浓度达7.41×10⁹孢子/g。在真菌液体发酵过程中添加产孢增效剂,有效提高了真菌产孢量,缩短了真菌培养周期,为提高真菌制剂生产效率、节约成本提供理论支持。     

金龟子绿僵菌黏附素基因mad1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT₅₀为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC1、PCD4,抗病基因SWEET10及转录因子WRKY41、MYB86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML5、CML19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些...     

绿僵菌R8-4菌株大量培养固相阶段的条件

研究了昆虫病原真菌绿僵菌R8—4菌株液固两相法培养过程中固相培养阶段的条件，包括培养基载体、接种量、接种后基质含水量、培养过程中的温度、光照、通气量等因素对产孢量的影响。结果表明：蛭石和稻壳均可作为固相培养的优良载体，以蛭石为载体的产孢量稍高于稻壳。玉米粉和麦麸组合是该菌的良好营养源，与不同载体配合均可使产孢量达到20×100孢子／g以上；以小米提供营养的不如麦麸加玉米粉，当小米与载体的质量比大于3：1可获得15×100孢子／g的产孢量。液固接种比以8：10最佳；接种后适宜的基质含水量约为55％，产孢量达28．9×10^8孢子／g；在培养过程中，恒温培养时以25℃为宜；最佳温度调节方式是先在25℃下培养16d后转移到21℃下再培养5d，可获得最高产孢量；光照调节对菌株生长和产孢有重要影响，培养前期在暗环境培养14d，再于光照培养7d的产孢量最高；高通气量利于菌株生长和产孢，应保持容器通气口通畅，培养基厚度以〈4cm为宜。     

绿僵菌CQMa128乳粉剂对蛴螬时间-剂量-死亡率模型分析

用拌土法测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株CQMa128乳粉剂对蛴螬3龄幼虫的毒力。结果表明：土壤含有1×106~1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂时,蛴螬的校正死亡率随着绿僵菌孢子浓度的增加和作用时间的延长而增大,土壤含有5×107孢子/g绿僵菌乳粉剂时蛴螬的校正死亡率达85.2%。运用时间-剂量-死亡率模型对生测数据进行拟合,通过Hos-mer-Lemeshow拟合异质性检验,并估计了该制剂对蛴螬的致死剂量与致死时间。随着接种天数的增加,相应的LD50和LD90随之降低,剂量效应逐渐增强。土壤中含有3×107、5×107和1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂处理的LT50值分别为10.18、8.42、6.79d。当土壤含有1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂时,蛴螬死亡率可达90%以上,LT90为10.50d。该绿僵菌制剂在蛴螬的生物防治中具较强的应用潜力。     

金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响

丝状真菌的fluG基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中fluG的作用鲜有研究报道。本研究利用DNA同源重组方法,构建敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因ben作为筛选标记,fluG基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用PEG介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG突变株继代培养5代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明fluG基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。     

感染星天牛幼虫高致病力金龟子绿僵菌菌株的筛选

室内测定了6株金龟子绿僵菌菌株的菌落生长速率、产孢量及其对星天牛幼虫的致病力。结果表明：不同菌株生长速率和产孢量存在显著差异,在PPDA培养基上,菌株MaYTTR04和MaZPTR01的菌落生长较快,培养15 d后,菌落直径分别为6.3 cm和5.9 cm;产孢量以菌株MaYTTR04最大,MaZPTR01其次,分别为2.0×10^8孢子·cm^-2和1.1×10^8孢子·cm^-2,显著高于其他菌株。生物测定结果表明,不同绿僵菌菌株对星天牛幼虫的致病力差异显著,接种20 d后,星天牛幼虫累积死亡率在40%～96.7%之间;菌株MaZPTR01和MaYTTR04对星天牛幼虫致死率分别达到96.7%和93.3%;僵虫率也高,分别达到86.7%和80%;致死中时（LT50）短,分别为5.71 d和5.80 d。研究结果表明,菌株MaZPTR01和MaYTTR04对星天牛幼虫致病力较强,同时具备良好的生产性能,故可作为优良菌株用于星天牛的防治。     

不同菌株绿僵菌和白僵菌对刚竹毒蛾幼虫致病力及林间防治试验

刚竹毒蛾(Pantana phyllostachysae Chao)是福建省毛竹林的一种主要害虫,本研究应用5种金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株和1种白僵菌(Beauveria bassiana)菌株,对3龄初幼虫进行感染力测定,旨在筛选出感染该虫的高致病力菌株。结果表明:应用1.45×10 7孢子/mL孢悬液感染12 d后,3龄初幼虫的校正死亡率均达到63.16%以上;其中MaFzzL-01和Ma1291-2两个绿僵菌株对该幼虫的致病力分别为90.93%和84.21%,其LT50值分别为5.97 d和6.67 d,LC50值分别为1.727×10 4孢子/mL和2.029×10 4孢子/mL。结果说明:绿僵菌MaFzzL-01和Ma1291-2两个菌株对该幼虫的致病力强,且致死速度快。应用1.45×10 8孢子/mL孢悬液进行林间防治可以取得良好效果。     

金龟子绿僵菌孢子低温休眠与复苏

金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae（Metsch．）Sorokin]能寄生8个目30个科共约200多种昆虫、螨类及线虫，具有良好的杀虫效果，国内外已在害虫防治中作为生物防治手段实现了工厂化生产与大规模应用。目前，低温贮藏是最普遍的方法。随着虫生真菌制剂的生产与应用，其标准化的需求日益迫切，低温保藏的菌种在低温休眠与复苏阶段，孢子萌发率、生长速率及产孢量均是极为重要的指标，将直接影响孢子粉的生产效率及生产质量。本文主要报道了对金龟子绿僵菌IMI330189菌株进行低温贮藏后，其低温休眠与复苏阶段孢子萌发、生长速率及产孢量的变化规律。     

绿僵菌无纺布菌条制作工艺

在接种优良液体种子的基础上，以单位面积的产孢量为指标，筛选了制作多种蛀干害虫的病原——绿僵菌无纺布菌条的最佳营养组合及培养条件。结果表明，最佳营养条件为（g／L）：白砂糖20g、黄豆粉40g、蛋白胨6g；琼脂含量对产孢量无显著影响；最佳培养条件为：25℃下，相对湿度（RH）95％，产孢量可达3．6×10^8～3．7×10^8孢子／cm^2。     

新农药介绍

中文通用名称:金龟子绿僵菌英文通用名称:Metarriziumanisopliae(拉丁名)农药登记名称:5亿孢子/克百澳克杀蟑饵剂理化性质:5亿孢子/克百澳克杀蟑饵剂外观为浅绿色粗粉粒,有油脂香味。该饵剂含孢子量为每克金龟子绿僵菌孢子≥5亿个。该产品是用生物发酵法生产绿僵菌活孢子,再与相关助剂及填料加工而成的饵剂。其菌株是从贵州土样中筛选出对蜚蠊有效的绿僵菌,经鉴定,该菌株与金龟子绿僵菌在形态特征和培养特征上十分相似,其形态特征:菌株的菌落扩展较慢,菌丝体有隔、分枝,子梗直、有分枝、形成分生孢子梗联合成分生孢子座;瓶状小梗单生,有时…     

新农药介绍

中文通用名称:绿僵菌英文通用名称:Metarhizium anisopliae(拉丁文)农药登记名称及商品名:100亿孢子/毫升绿僵菌油悬浮剂(克洛卡)理化性质:该药的有效成分为金龟子绿僵菌的分生孢子。金龟子绿僵菌是由重庆缙山自然保护区黄脊竹蝗僵虫体内分离出的,菌株编号为CQ102。经鉴定该菌株CQ102属于菌物界、丰知菌亚门、丝孢纲、绿僵菌属、金龟子绿僵菌(异名:黄绿绿僵菌)。其菌落特征:在SDA(萨氏葡萄糖)培养基上菌落初期为白色茸状,产孢时灰绿色至橄榄绿色,自菌落中心由里向外长出成丛的绿色分生孢子堆。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列,帚状分枝…     

金龟子绿僵菌FM-03生物学特性及其对柑橘粉蚧的侵染

为明确金龟子绿僵菌FM-03菌株生物学特性及其对柑橘粉蚧的侵染效果,室内测定不同温度、pH、光周期、碳氮源对该菌株生长和产孢量的影响;观察柑橘粉蚧受该菌株侵染后的死亡趋势,构建该菌株对柑橘粉蚧的时间-剂量-死亡率（TDM）模型。结果表明,金龟子绿僵菌FM-03菌株培养最适的温度为25℃、pH 7、光周期12L：12D、碳源为乳糖、氮源为酵母膏,在此培养条件下菌落直径和产孢量分别可达6.17 cm和3.70×10⁹孢子/皿。柑橘粉蚧受菌株FM-03侵染后的死亡趋势随菌株浓度升高和侵染时间延长而上升,1×10⁸、1×10⁷和1×10⁶孢子/mL处理的升幅明显高于其他2个处理,其中在1×10⁸孢子/mL处理的累计校正死亡率最高可达82.02%;构建的TDM模型,通过Pearson卡方和Hosmer-Lemeshow检验,显示菌株FM-03对柑橘粉蚧的剂量效应随侵染时间的延长逐渐增强,时间效应随浓度的升高逐渐增强,侵染8 d后的LC₅₀和1.00×10⁸孢子/mL处理的LT₅₀分别可达6.03×10⁵孢子/mL和4.53 d。综上,金龟子绿僵菌FM-03菌株生长快、产孢量高,对柑橘粉蚧的致病力强,生防应用前景良好。     

小菜蛾高致病力绿僵菌的筛选、鉴定及培养特性研究

为开发蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的高致病力真菌生物农药,以3龄小菜蛾幼虫为供试虫源,测定了25株虫生真菌菌株对小菜蛾的致病力,从中筛选出1株对小菜蛾幼虫有较高致病力的菌株CQM125。生测结果显示,在20℃、1.0×108孢子mL 1菌株CQM125菌液处理小菜蛾幼虫的LT50为3.97 d;25℃、5.0×107孢子mL 1菌液的LT50为2.44 d;在25℃下,第7 d的LC50为2.31×104孢子mL 1;接种处理后,20℃、8 d的小菜蛾死亡率为84.22%,对小菜蛾表现出良好的控制效果。依据菌株的形态特征、培养性状和rDNA ITS序列分析将菌株CQM125鉴定为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。对该菌株的培养基和培养条件进行了优化,优化后的产孢培养基为PPDA,其中葡萄糖2%,蛋白胨0.5%;最适产孢温度30℃,最适产孢pH值为6.0;最适光照条件为前6 d黑暗,后8 d光照。     

金龟子绿僵菌油悬浮剂的孢子萌发率测定方法优化研究

金龟子绿僵菌是一种重要的生防真菌,本文系统研究了金龟子绿僵菌油悬浮剂孢子萌发的最佳条件,结果表明:选用初始pH=6的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行平板萌发测定,制作孢子平板后进行吹干处理,放置于温度30℃、湿度90%的条件下进行黑暗培养30h,所测得的孢子萌发率最高。该测定条件可用于金龟子绿僵菌油悬浮剂产品孢子萌发率的测定。     

绿僵菌对“Q型”烟粉虱2龄若虫的致病性及与毒力关联的培养性状研究

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是我国农业上重要害虫,已对当今市场上多种杀虫剂产生严重抗性。本文研究了8株来自不同寄主的绿僵菌Metarhizium spp.菌株对Q隐种烟粉虱2龄若虫的致病性和与毒力关联的培养性状。结果表明,菌株Mf96对"Q型"烟粉虱2龄若虫具有很强的毒力,以1.0×108孢子/m L的孢子液接种到2龄若虫体表上,累积校正死亡率达89.5%,LT50为3.65 d,致死率明显高于其它菌株。以1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105孢子/m L悬浮液处理时,烟粉虱2龄若虫累计死亡率随浓度和接种后时间增加而增加,LC50为1.20×107孢子/m L。供试的8株绿僵菌菌株的胞外蛋白酶也被测定,菌株Mf96的胞外蛋白酶活性最高,达3.64 U/m L。菌株Mf96在SDAY培养基上,具有生长速度快、萌发率高和产孢量大等优点。菌株Mf96在烟粉虱的生物防治中具有较大的应用潜力。     

4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的室内毒力测定

以朱红毛斑蛾幼虫为研究对象,研究1株自朱红毛斑蛾幼虫僵虫上分离得到的球孢白僵菌Beauveria bassiana PfBb,与3种常用虫生真菌(金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae Mafz01、卵孢白僵菌B. brongniartii 400和球孢白僵菌B.bassiana DSXJ-07)进行致病力比较,以期筛选出高效的虫生真菌用于朱红毛斑蛾的生物防治。采用浸虫法,测定4种虫生真菌不同浓度下朱红毛斑蛾幼虫的校正死亡率及僵虫率。室内毒力测定结果表明,金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07和球孢白僵菌PfBb对朱红毛斑蛾幼虫的致死中浓度分别为3.1×10~8、1.1×10~8、1.9×10~7和2.8×10~5孢子/mL;1.0×10~9孢子/mL浓度处理下的僵虫率分别为52.5%±6.45%、52.5%±6.45%、73.75%±6.29%和97.50±2.89%,且球孢白僵菌PfBb处理后的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率显著高于其他3种虫生真菌。4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫毒力大小依次为球孢白僵菌PfBb球孢白僵菌DSXJ-07卵孢白僵菌400金龟子绿僵菌Mafz01。推荐使用浓度大于1.0×10~7孢子/mL的球孢白僵菌PfBb防治朱红毛斑蛾幼虫。     

一株罹病草地贪夜蛾成虫莱氏绿僵菌的分离鉴定及其致病力

从草地贪夜蛾成虫尸体中分离获得一株杀虫真菌。经形态和分子鉴定,确定该虫生真菌为莱氏绿僵菌,并命名为Nr Sfadult202104。生物学特性的研究结果显示,该菌株在SMAY+0.5%草地贪夜蛾蛹粉培养基上生长速率和分生孢子产量最佳;在28℃时菌落生长速率最快,20℃时产孢最为适宜;在全光照条件下该菌株产孢量最高。对草地贪夜蛾成虫和3龄幼虫的致病力测定结果显示,该菌株对草地贪夜蛾雌、雄成虫以及3龄幼虫都具有一定的毒力效果。当孢子浓度为1.0×10⁸孢子/m L时,其感染雌、雄成虫校正死亡率分别为61.2%和58.1%;菌株接种3龄幼虫后,随孢子悬浮液浓度的升高,幼虫的感病死亡率也随之增加,当浓度达到1.0×10⁸孢子/m L时,3龄幼虫的致死中时(LT₅₀)为5.30 d,接种8 d后3龄幼虫的校正死亡率为66.12%。综合以上结果,莱氏绿僵菌Nr Sfadult202104菌株对草地贪夜蛾具有潜在的生防作用,值得深入研究。     

虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢、致病力及其相关基因的表达特征

为明确绿僵菌在其致死害虫表面生长发育和致病力等相关分子机制,通过显微观察大蜡螟Galleria mellonella虫尸表面罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii生长和产孢特性,并测定其致病力,分别对虫尸表面和PDA培养基上罗伯茨绿僵菌的菌丝生长阶段和大量产孢阶段进行高通量测序,对虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢及致病力通路相关基因进行系统分析,并采用荧光定量PCR技术对高通量测序结果进行验证。结果表明,PDA培养基上培养5 d后,罗伯茨绿僵菌开始大量产孢,培养14 d时产孢量最高,为4.6×10~7个/cm~2,大蜡螟幼虫注射罗伯茨绿僵菌4 d后,其体表出现菌丝,5.5 d后虫尸表面罗伯茨绿僵菌大量产孢,9 d后产孢量最高,为2.6×10~8个/cm~2。与PDA培养基上罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(7.09 d和4.66 d)相比,体壁侵染法和显微注射法侵染的虫尸表面罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(6.33 d和4.49 d)分别显著缩短和无显著变化。高通量测序结果显示,在菌丝生长阶段和大量产孢时期,虫尸表面罗伯茨绿僵菌中共有810个基因上调表达,452个基因...     

18种化学农药与绿僵菌相容性研究

本文检测了18种常用低毒化学农药对生防真菌绿僵菌Metarhizium anisopliae孢子萌发、菌丝生长及产孢的影响,分析它们与绿僵菌的相容性。总体看,杀虫剂、植物生长调节剂和除草剂与绿僵菌的相容性好于杀菌剂。其中,氰戊菊酯与绿僵菌相容性最好,即使在10倍的推荐浓度下,对孢子萌发无影响,对菌丝生长速度和产孢量的抑制率只有25.13%和38.63%。高效氯氟氰菊酯和乐果与绿僵菌也有较好的相容性,在推荐的田间使用浓度下,孢子萌发抑制率为30%左右,对菌丝生长和产孢量基本没有抑制。溴氰菊酯、啶虫脒、吡虫啉、甲霜灵、氟乐灵、阿维菌素、敌百虫、毒死蜱和波尔多液与绿僵菌有一定的相容性。矮壮素、哒螨灵、多菌灵、甲基硫菌灵、代森锰锌和三唑酮与绿僵菌相容性很差。