Molecular cloning and functional characterization of apple U-box E3 ubiquitin ligase gene MdPUB29 reveals its involvement in salt tolerance

An E3 ubiquitin ligase gene(Genbank accession no.: MD01 G1010900) was cloned from the Royal Gala apple genome(Malus×domestica Borkh.). Sequence analysis showed that the length of the MdPUB29 gene was 1 275 bp, encoding 424 amino acids. Phylogenetic tree analysis indicated that the apple E3 ubiquitin ligase exhibited the greatest sequence similarity to Pyrus×bretschneideri. The predicted protein structural domain of MdPUB29 showed that it contained a U-box domain. qRT-PCR analysis showed that Md PUB29 was expressed widely in different tissues of the Royal Gala apple species, and was highly expressed in the root, while the expression of MdPUB29 was significantly inhibited by exogenous NaCl. Immunoblotting assays revealed that MdPUB29 protein abundance in tissue cultures of the Royal Gala apple accumulated under NaC l stress conditions. Three-dimensional protein structure prediction indicated that MdPUB29 was highly homologous with AtPUB29. The growing potential of MdPUB29-expressing apple calli and Arabidopsis were much stronger than that of the control under salt stress conditions, suggesting that MdPUB29 may positively regulate salt tolerance.     

Genome-wide identification and function analysis of the sucrose phosphate synthase MdSPS gene family in apple

Sucrose phosphate synthase(SPS) is a rate-limiting enzyme that works in conjunction with sucrose-6-phosphate phosphatase(SPP) for sucrose synthesis, and it plays an essential role in energy provisioning during growth and development in plants as well as improving fruit quality. However, studies on the systematic analysis and evolutionary pattern of the SPS gene family in apple are still lacking. In the present study, a total of seven MdSPS and four MdSPP genes were identified from the Malus dome...     

木薯淀粉分支酶基因MeSBE2.2的克隆和表达分析

为了明确淀粉分支酶(SBE)在木薯淀粉合成中的功能,利用RT-PCR方法克隆得到了MeSBE2.2序列,并通过实时定量PCR(Q-PCR)分析其转录特点。结果表明,MeSBE2.2全长2 053bp,编码616个氨基酸,其编码蛋白质序列与蓖麻SBEII氨基酸序列的同源性最高,为91%。研究其转录特点发现:MeSBE2.2在块根和叶片中的表达模式有品种间差异性;器官特异性表达分析结果表明,MeSBE2.2主要在木薯块根中柱中表达;于3个不同生长时期的表达分析发现,MeSBE2.2在块根中表达平稳,在叶片中其表达量随植株生长呈显著下降趋势。本研究结果为进一步研究SBE家族在木薯块根淀粉合成中的功能提供了重要依据。     

玉米BBX基因家族鉴定及表达分析

BBX(B-box)是一类光温响应转录因子家族参与植物光形态建成及逆境响应。为揭示ZmBBX家族基因功能,采用生物信息学方法在玉米基因组水平对该基因家族进行鉴定,并对其基本理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件和基因表达谱进行分析。ZmBBX基因家族共有34个成员,划分为5个亚族,编码蛋白氨基酸介于142～498 aa,预测大多数成员定位于细胞核内。ZmBBX基因启动子存在大量的光响应元件、胁迫响应元件、激素应答元件和生长发育相关的顺式作用元件。全生育期组织表达谱发现, ZmBBX7、 ZmBBX27和 ZmBBX28在玉米的全生育期均高表达, ZmBBX3、 ZmBBX5、 ZmBBX14、 ZmBBX15、 ZmBBX19和 ZmBBX20在玉米叶片中表达量较高, ZmBBX6、 ZmBBX11、 ZmBBX18和 ZmBBX32在玉米叶片和种子形成前期等时期表达量较高。同时,对实验室盐处理转录数据分析发现, ZmBBX1、 ZmBBX3、 ZmBBX9、 ZmBBX12、 ZmBBX13、 ZmBBX21、 ZmBBX25、 ZmBBX29和 ZmBBX33 9个基...     

苹果WRKY基因家族生物信息学及表达分析

【目的】鉴定苹果（Malus domesticaBorkh.）基因组上132个WRKY基因,为研究苹果WRKY转录因子在非生物和生物胁迫以及生长和发育过程中的调控作用奠定相关理论基础,也为进一步分析苹果WRKY基因提供信息。【方法】利用HMMER 3.0软件,通过WRKY保守域全蛋白序列PF03106用于鉴定苹果WRKY基因。采用WebLogo 3、DNAMAN 5.0、MapInspect、MEME和MEGA5.1等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术检测苹果WRKY基因的组织表达情况。【结果】鉴定得到132个苹果WRKY基因。分组鉴定和进化树分析结果显示,苹果WRKY蛋白分为I、II和III类型,I组共有24个成员可进一步分为I-C和I-N亚组,其锌指结构是C₂H₂类型（CX₄CX_22-23HXH）。II组含有1个WRKY区域共有79个成员,可进一步分为II-a、II-b、II-c、II-d和II-e亚组,分别有8、12、31、14和14个成员,其锌指结构为C₂H₂类型（CX_4-5CX₂₃HXH）。III组共有29个成员,其锌指结构为C₂HC类型（CX₇CX_23-24HXC）;WRKY结构域分析显示,其高度保守,绝大多数都含有WRKYGQK七肽和锌指结构;染色体定位分析显示,苹果WRKY分布于苹果17条染色体中,呈不均匀分布。染色体1和9上分布最多,为13个;其次是染色体12,分布12个;染色体2、5和14分布最少,为4个;基因结构分析表明,MdWRKY基因家族多数由2-5个外显子组成,基因结构进化高度保守;保守元件分析表明,MdWRKY基因家族包含10个保守元件：元件1-6为WRKY盒;元件7-10为未知盒。MdWRKY基因家族都包含有WRKY盒,I组中含有2个WRKY盒,II-a和II-b亚组中含有未知元件8,III组中含有未知元件7和9。半定量结果显示,12个MdWRKY均在根、茎、叶、花和果中表达,且呈现出多种相对表达模式。【结论】苹果WRKY基因家族结构高度保守,可能参与调控苹果生长和发育等过程。     

苹果液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1的克隆与表达分析

【目的】研究新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1生物学信息、表达水平及其在糖代谢中的功能,旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’为试材,克隆MdVGT1,对其进行生物信息学分析;并采用荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同发育时期的表达,分析‘嘎啦’组培苗中该基因在葡萄糖诱导下的表达,通过酵母双杂交验证其互作关系,并通过原核诱导获得重组蛋白。【结果】在‘红脆1号’中克隆获得MdVGT1全长,测序发现其包含1 506 bp完整的开放阅读框,编码501个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为53.16 kD,等电点为5.92,定位于苹果基因组的1号染色体上,由14个外显子和13个内含子构成;糖代谢相关基因系统进化树分析表明,MdVGT1与AtVGT1、VvVGT1、CsVGT1在同一个进化枝上,功能域分析表明,MdVGT1蛋白含有12个跨膜区域;MdVGT1在苹果的花、叶和幼果中均有较高的表达,在果实发育中,其表达量与葡萄糖含量有显著的相关性;MdVGT1启动子含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件;葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗一周后,MdVGT1的表达量明显提高;酵母双杂交试验表明,MdVGT1与MdTMT1在体外能相互作用,并通过原核诱导获得了MdVGT1的重组蛋白。【结论】在‘红脆1号’苹果中克隆获得了液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1,其可能与MdTMT1互作共同转运葡萄糖进入液泡膜。     

长期继代培养的转基因苹果外源基因遗传及表达稳定性分析

为研究长期继代培养的转基因苹果组培苗中外源基因的遗传及表达稳定性,以继代培养9年的7个转GFP(绿色荧光蛋白)基因苹果株系组培苗为试材,分析转基因株系对Kan(卡那霉素)的抗性、DNA水平、转录水平和转录后水平GFP基因的遗传及表达稳定性。结果表明,在7个苹果转基因株系组培苗中均可检测出GFP特异基因片段,并且均可在含有50 mg/L卡那霉素的培养基上正常生长;绝对定量qRT-PCR检测发现,各转化株系GFP基因拷贝数并不相同;利用相对定量qRT-PCR法检测发现7个株系中GFP基因 mRNA表达量有明显差异,同时荧光显微镜下观察各转化株系叶片,绿色荧光强度有明显差异,利用SPSS软件对7个转基因株系中GFP基因拷贝数与GFP mRNA表达量相关性分析结果呈无显著相关性。以上结果表明,外源基因可以在长期继代培养的转基因苹果组培苗中保持其遗传稳定性,但不同转化株系中外源基因的表达量有显著差异,其表达量与拷贝数无显著相关,可能与外源基因在植物基因组中的插入位点有关。     

甘蔗脱毒健康种苗蔗糖磷酸合成酶基因差异表达分析

[目的]探究甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达对产量和糖分积累影响的作用机理,为提高甘蔗产量和蔗糖含量提供理论参考.[方法]以甘蔗品种新台糖22号的脱毒健康种苗和未脱毒种苗(CK)为供试材料,分别在苗期、分蘖期、拔节期和成熟期进行混合取样,包括未成熟叶、成熟叶、幼茎和成熟茎,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测分析对不同类型SPS基因(SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1和SPSD2)在不同生长时期不同组织中的表达情况.[结果]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同部位均有表达,SPSD1和SPSD2基因在未成熟叶和成熟叶中表达量差异明显,且与CK间也存在明显差异,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗1~3茎节中的表达量高于CK.在拔节期10~23茎节中,SPSA基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSB基因的表达量较CK高,SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.在成熟期10~37茎节中,SPSB基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSA、SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.总体上,随茎秆节间成熟度的增加,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗中的表达量与CK差异逐渐减小.[结论]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同生长时期不同组织中均差异表达,推测甘蔗脱毒处理能促进叶片和未成熟茎节中SPS基因的表达,有利于提高甘蔗产量和蔗糖含量.     

枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1的克隆及AM真菌对其表达的影响

【目的】克隆‘早钟6号’枇杷（Eriobotrya japonica ‘Zaozhong 6’）的一个质膜水孔蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）基因,分析其序列特征,研究接种丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal,AM）真菌对枇杷水分利用效率（water use efficiency,WUE）及对质膜水孔蛋白基因表达模式的影响。【方法】以‘早钟6号’枇杷实生苗为材料,通过盆栽试验,设置2个处理（AM和NM）,5个重复,利用光合测定系统对叶片水平上水分利用效率进行测定;采用RT-PCR和RACE技术克隆该基因的cDNA全长,结合生物信息学软件对其序列特征进行分析,利用实时荧光定量PCR（Real time-PCR）分析接种AM真菌后该基因在枇杷叶片和根中的表达模式。【结果】在有效的光合同化时间（7：00-17：00）内,接种AM真菌显著的提高了枇杷的水分利用效率。克隆得到枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1（GenBank登录号：JX041627）,cDNA全长为1 142 bp,编码区含861 bp,共编码286个氨基酸。氨基酸序列分析表明,EjPIP1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala,天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序。同源性分析显示,枇杷EjPIP1氨基酸序列与已报道的苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）和智利草莓（Fragaria chiloensis）等高等植物的氨基酸序列同源性很高,分别为97%、92%和90%。Real time-PCR分析结果证实,EjPIP1在枇杷叶片和根中均有表达,并且叶片中的相对表达量略高于根中。正常供水条件下,接种AM真菌后,该基因在根中表达上调,在叶片中表达下调。【结论】接种AM真菌提高了‘早钟6号’枇杷叶片水平上水分利用效率。从枇杷叶片中克隆得到了一个质膜水孔蛋白类的基因EjPIP1,实时荧光定量PCR分析表明该基因在枇杷叶片和根中表达受AM真菌的影响,该基因的表达模式有利于提高AM植株的水分利用效率。     

基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

【目的】探明水杨酸(SA)对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸(SA)处理12 h,以CTRL(0.2%乙醇)处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析(差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等)筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因(如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等),调控植物病原菌互作途径重要功能基因(钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等)以及33个条件特异性诱导表达基因(NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等)。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成,植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于Md WRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列,为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列,另外,Md WRKY40转录调控存在反馈抑制机制。     

拟南芥 AtNHX5基因启动子的克隆和组织定位分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体 AtNHX5基因启动子（proNHX5）功能及基因的组织表达模式,从基因组中克隆 AtNHX5基因开放阅读框（ORF）上游侧翼调控区1 807 bp序列,发现该启动子具有典型启动子一般特征,不仅具有TATA-box、CAAT-box等核心元件,还含有与光响应、激素响应、逆境诱导响应和分生组织表达调控元件。构建 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得转基因植株。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式,发现在子叶、下胚轴和花中有显著的GUS酶活性,成熟叶片和根中只有局部检测到GUS表达,在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS酶活性,说明 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建且正常启动GUS基因表达,同时也表明, AtNHX5基因主要在这些部位表达,且表达具有时空特异性。     

水、旱稻差异表达抗旱候选基因的序列分析

为研究在水、旱稻差异表达的抗旱候选基因、解释旱稻抗旱的分子机理,本研究选取已获得的水、旱稻干旱胁迫处理基因表达谱中在旱稻中高表达的候选基因,对其编码区和启动子区进行测序分析,以期比较可能的抗旱相关基因在水、旱稻基因组水平上的异同.根据水、旱稻差异表达结果,筛选出8个旱稻高表达基因.通过测序分析发现7个基因在水、旱稻间没有差异,只有一个候选基因OsMIP在典型水稻(日本晴、越富)和典型旱稻(IRAT109、毫格劳)启动子区之间存在18个SNP和1个Deletion的序列差异,说明在干旱胁迫下,旱稻高表达基因中只有少数存在序列上的差异.为进一步验证OsMIP的启动子区在水、旱稻问的序列差异,利用国内、外86份水、旱稻材料对该基因的启动子区进行测序分析,所得到的所有启动子序列可分为4种单倍型H1、H2、H3和H4,在单倍型H2中获得与抗旱相关的8个SNP和1个Indel,推测该基因的启动子区域的一个或多个序列差异可能是引起水、旱稻OsMIP基因差异表达的原因.     

棉花离体不定根系的发生对色素腺体密度和棉酚含量的影响

为探明根系对色素腺体密度和棉酚含量的影响,以离体条件下的无根幼苗、不同生根状态幼苗以及无菌种子苗作为研究对象,对其茎叶色素腺体密度、棉酚含量以及棉酚生物合成关键基因表达量进行分析。结果表明,不同生根状态幼苗中,色素腺体密度和棉酚含量与一定范围内生根数呈显著正相关,随后趋于平稳。荧光定量PCR显示,棉酚生物合成关键基因GhCDN1和GhWRKY1表达量在生根数多的无菌苗中显著增高,而对棉酚合成具有反馈调节作用的 GhCYP706B1表达量呈现相反趋势;无根幼苗茎叶腺体密度和棉酚含量均显著低于有根幼苗,棉酚生物合成关键基因GhCDN1、GhWRKY1和 GhCYP706B1表达量反而高于有根幼苗。有根幼苗中根的棉酚含量显著高于茎和叶,无菌种子苗根系中棉酚生物合成关键基因表达量显著高于茎和叶。说明棉花根系能对棉酚含量产生直接影响,同时影响腺体密度。本研究进一步验证了根系是棉酚主要合成部位,地上部分也存在少量的棉酚合成,只是不能引起棉酚发生显著变化。     

番茄果实LeNCED2基因的克隆及其表达分析

为了解ABA对果实发育和成熟的调控作用,对与ABA合成相关的LeNCED2基因进行了克隆与分析.采用RT-PCR和RACE技术从番茄品种‘嘉宝'(Solanum lycopersicum cv.Jiabao)果实中克隆得到了一个LeNCED1基因的同源片段,定名为LeNCED2(基因库注册号:EU912387).该基因3'端序列为1635 bp,与LeNCED1基因的DNA序列同源性为72.7%,与马铃薯中的StNCED2基因(AY662343)碱基序列同源性高达95%.碱基序列推导的蛋白序列与LeNCED1基因的同源性为80%.RT-PCR分析显示LeNCED2基因在番茄植株的根、茎、叶、花和萼片上都有表达.Real-time RT-PCR分析显示LeNCED2基因在幼果期表达量较高,随着果实成熟逐渐降低,与ABA含量不一致.而LeNCED1基因在转色期表达量最大且与ABA含量相对应.     

Genome-wide identification,molecular evolution,and expression divergence of the hexokinase gene family in apple

Hexokinase(HXK) is the first irreversible catalytic enzyme in the glycolytic pathway, which not only provides energy for plant growth and development but also serves as a signaling molecule in response to environmental changes. However, the evolutionary pattern of the HXK gene family in apple remains unknown. In this study, a total of nine HXK genes were identified in the Malus×domestica genome GDDH13 v1.1. The physiological and biochemical properties, exonintron structures, conserved motifs, and cis-elements of the MdHXK genes were determined. Predicted subcellular localization indicated that the MdHXK genes were mainly distributed in the mitochondria, cytoplasm, and nucleus. Gene duplication revealed that whole-genome duplication(WGD) and segmental duplication played vital roles in MdHXK gene family expansion. The ω values of pairwise MdHXK genes indicated that this family was subjected to strong purifying selection during apple domestication. Additionally, five subfamilies were classified, and recent/old duplication events were identified based on phylogenetic tree analysis. Different evolutionary rates were estimated among the various HXK subfamilies. Moreover, divergent expression patterns of the Md HXK genes in four source-sink tissues and at five different apple fruit developmental stages indicated that they play vital roles in apple fruit development and sugar accumulation. Our study provides a theoretical basis for future elucidation of the biological functions of the MdHXK genes during apple fruit development.     

柱状苹果Co基因的筛选与候选基因分析

【目的】柱状苹果是一种特殊的矮生突变类型,其节间短、短枝多、侧生分枝少、主干粗壮直立,是苹果实行矮化密植栽培的重要资源。本研究在前期Co精细定位的基础上,对定位区间的基因进行筛选,为阐明柱状苹果形成的分子机制和选育柱状苹果新品种奠定基础。【方法】以柱状苹果‘舞佳’和‘润太一号’,普通型苹果‘富士’和‘华硕’的芽、茎尖和叶片为试材,根据最新的苹果基因组以及与柱状相关的转录组信息,对Co精细定位区间27.66—29.05 Mb的基因进行注释分类,选择目标基因,查找其CDS序列,使用RT-PCR技术检测引物特异性,利用实时荧光定量PCR分析预测基因在不同组织器官中的表达特征,筛选出差异基因并将其作为候选基因。【结果】在苹果第10号染色体27.66—29.05 Mb区域内包含67个基因,其中12个为非编码RNA（ncRNA）,其余为编码蛋白质的基因。根据RNA-seq分析,柱状和普通型苹果基因相对表达差异倍数在1倍以上的有25个基因,其中13个基因在柱状苹果中上调表达,12个基因在柱状苹果中下调表达。在预测的14个基因中,发现4个基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500在柱状和普通型苹果的主枝茎尖或侧枝茎尖中相对表达存在显著差异。其中,MD10G1184100和MD10G1185600在两个柱状苹果主枝茎尖中的相对表达量均显著高于两个普通型苹果。MD10G1185400和MD10G1190500在两个柱状苹果侧枝茎尖的表达量显著高于两个普通型苹果,而MD10G1184100在两个柱状苹果中的表达量显著低于普通型苹果。进一步对这4个候选基因进行不同组织或器官的基因表达特征进行分析,发现基因MD10G1184100在柱状苹果根部的表达显著高于其他部位,MD10G1185400和MD10G1185600在柱状苹果的侧枝茎尖中显著高表达,而MD10G1190500在柱状苹果的顶芽中显著高表达。【结论】在柱状和普通型苹果茎尖中筛选到4个表达显著差异的基因,可作为Co候选基因,为该基因的克隆和功能验证及苹果树树型定向遗传改良奠定了基础。