云南烟草丛枝症病原及传媒研究初报

云南烟草丛枝症一直被认为是烟草丛枝病，其病原是植原体。由于生物学测定结果与植原体病害一般特性不尽相符，对云南烟草丛枝症的病原尚难以确定。我们对典型烟草丛枝症的原发病株和转接发病株按照检测植原体的方法提取DNA。扩增病株中植原体16S rDNA片段，在云南烟草丛枝症中没有检测到植原体的存在。在检测DNA提取物含量过程中，原发病株和转接发病株样品中检测出含量较高的RNA带，分子量约0．8kb；而健康烟株策和枣疯病株中未检测出，由此说明云南烟草丛枝症的病 原不是植原体，病株中检测出的RNA带是该病的病原还是感病后的诱导产物，有待进一步研究；RNA可作为室内鉴别烟草丛枝症的方法。在理论上证明烟蚜是烟草丛枝症的传播媒介，同时估计云南烟草丛枝症的病原是病毒，并与以往国内报道的烟草病毒病害不同，可能是一种新的病毒病害。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅲ细胞的超微病变

 超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织,并抽提试验材料的总核酸电泳检测,结果表明:病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA,切片中未观察到病毒粒子,薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变:质膜体(plamalemmasome)和双层膜泡囊(double membranous vesicles).质膜体由细胞质膜或液泡膜伸入空泡形成,直径约1000～2000nm,结构类似于类病毒侵染寄主形成的旁壁体.双层膜泡囊是含纤维状物内含物的泡囊,直径约100～200nm,结构类似于某些病毒侵染寄主形成的细胞质泡囊(cytoplasmic vesicles)和植原体(phytoplasmas),但因其广泛分布于寄主细胞中,不能认为是植原体.文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征,初步认为云南烟草丛枝症病害可能是病毒病害,发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征,此与莫笑晗等发现病株体内含有大量低分子量RNA可能有密切关系.     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅻ病原研究：病毒问题

 云南烟草丛枝症病害病程表现为潜伏、过敏反应、缩顶、丛枝等4个阶段,以过敏反应导致叶片严重坏死和枯死为前期特征,以腋芽丛生而表现为黄化丛枝症为后期特征,苗期感染形成僵苗症,大田期感染表现丛枝症;汁液摩擦接种11科32种植物发现其只侵染烟属植物,通过机械传染(嫁接、汁液) 和介体传染(菟丝子、蚜虫、烟盲蝽、叶蝉) 等方式传播,该病害与文献记载的烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,可能是未见记载的病害。在云南烟草丛枝症病株的老叶和带毒蚜虫中抽提到直径约22～24nm的球状病毒,回接烟草发病,病株检测到和云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA,说明该病毒和云南烟草丛枝症病害有密切的关系,且与SBMV,VTMV,TRSV,ArMV,CarMV,CMV,BCMV,TNV等8种病毒无血清学关系,综合各项研究和文献检索结果,作者推测该病毒可能是未见记载的病毒,建议称为"烟草簇矮病毒(Tobaco bushy dwarf virus)"。     

云南烟草丛枝症病害研究 II细胞的超微病变

超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织,并抽提试验材料的总核酸电泳检测,结果表明：病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ,切片中未观察到病毒粒子,薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变：质膜体（ｐｌａｍａｌｅｍｍａｓｏｍｅ）和双层膜泡囊（ｄｏｕｂｌｅｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｖｅｓｉｃｌｅｓ）．质膜体由细胞质膜或液泡膜伸入空泡形成,直径约１０００～２０００ｎｍ,结构类似于类病毒侵染寄主形成的旁壁体．双层膜泡囊是含纤维状物内含物的泡囊,直径约１００～２００ｎｍ,结构类似于某些病毒侵染寄主形成的细胞质泡囊（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｖｅｓｉｃｌｅｓ）和植原体（ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ）,但因其广泛分布于寄主细胞中,不能认为是植原体．文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征,初步认为云南烟草丛枝症病害可能是病毒病害,发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征,此与莫笑晗等发现病株体内含有大量低分子量ＲＮＡ可能有密切关系．     

云南烟草丛枝症病害的超微细胞病变研究

超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织，并抽提试验材料的总核酸电泳检测。病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA，切片中未观察到病毒粒子和植原体等病原，薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变：质膜体和细胞质泡囊，质膜体(1000～2000nm)结构类似于病毒形成的旁壁体。细胞质泡囊(100-200nm)是含纤维状物的双膜的囊。运用不同盐浓度介质的RNase处理病变细胞组织，发现高盐介质的Rnase(2XSSX)不能消解小囊泡中的纤维状物，而低盐介质的Rnase(O．01XSSC)可以消解小囊泡中的纤维状物。文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征，初步认为这是云南烟草丛枝症病害发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征。     

云南烟草丛枝症病害研究 IV建立标准毒株

以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育３代,以第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳．结果表明：第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ．说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株．     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅳ建立标准毒株

 以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育3代,以第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳.结果表明:第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA.说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株.     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅸ追踪致病因子

 云南烟草丛枝症病害病株的粗汁液、PEG沉淀物、粗提纯物、酚处理物、总核酸均具有致病性。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅺ病原研究：类病毒问题

 感染云南烟草丛枝症病害的病苗的细胞切片中观察到类似于旁壁体的质膜体,旁壁体是类病毒侵染植物形成的特征病变结构,但多次双向电泳实验均未检测到类病毒分子,质膜体的形成可能和莫笑晗等发现的与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RNA有密切关系,但线性开环结构和失活温度说明其不具有类病毒核酸特征。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅰ病害的症状学及其病程

 以云南烟草丛枝症病株为毒源,通过蚜虫传染接种大十字期、猫耳朵期、摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期的烟株,观察症状反应并检测与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA.研究表明:云南烟草丛枝症病害的病程可分为4个阶段:潜育期、过敏反应期、缩顶期和丛枝期,烟株从感染到表现丛枝要经过约1个月;蚜虫接种后约1周,在蚜虫口针刺吸部位开始出现褪绿斑,继而产生强烈的过敏反应,即从褪绿斑中心开始坏死出现蚀点斑,叶片上布满坏死斑纹,有典型的环纹和蚀纹,严重的烟株叶片破裂,细脉坏死;随后进入缩顶期,烟株生长缓慢,叶间距明显缩短,顶部几乎成为一个平面,叶色稍黄,大十字期和猫耳朵期接种烟株缩顶后生长极其缓慢,萎缩成为僵苗,不表现丛枝症状,也不会开花结实;感染约4周后,摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期接种的烟株开始腋芽丛生,生长速度加快,几天后便表现为典型的黄化丛枝症状,叶黄化且变圆,能够开花结实.其症状和文献记载的所有烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,初步认为是1种未见记载的新病害,建议称之为“烟草簇矮病(Tobaco bushy dwarf)”.文中附病程症状图2版.     

云南烟草丛枝症病害研究 Ⅷ 验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

来自云南省２２个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定ＲＮＡ,大小相当于８００ｂｐ左右的ＤＮＡ;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此ＲＮＡ,种子中未检测到此ＲＮＡ;此ＲＮＡ的最大吸收峰为２６９ｎｍ;能被蛇毒磷酸二酯酶Ｉ消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此ＲＮＡ的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为１６１ｋｂ的单链ＲＮＡ．与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ目前发现的超稳定ＲＮＡ．     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅷ验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

 来自云南省22个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RNA,大小相当于800bp左右的DNA;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此RNA,种子中未检测到此RNA;此RNA的最大吸收峰为269nm;能被蛇毒磷酸二酯酶I消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此RNA的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为1.61kb的单链RNA。与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA目前发现的超稳定RNA。     

白背飞虱传播云南烟草丛枝症研究

 我们在烟草丛枝症病害（Tobacco witches’ broom symptom diseases ）的媒介昆虫研究中首次发现白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath）成虫（长翅型）能传播该病,并对其传毒特性进行研究发现：3头带毒白背飞虱成虫便可传毒,每烟株上超过15头带毒白背飞虱传毒率达最大,最短获毒时间为5 min,当获毒时间为24 h传毒率达最大,当接种时间达48 h传毒率达最大。由于云南省多数烟区烟田与稻田混杂,在烟田中存在相当数量的白背飞虱。因此,白背飞虱是烟草丛枝症病害的重要传毒介体之一。     

云南烟草丛枝症病害研究 Ⅶ 激素的变化

采用植物激素ＥＬＩＳＡ测定试剂盒,对比测定了烟草感染丛枝症的病株与健株体内细胞分裂素（ｉＰＡ和ＺＲ）与生长素（ＩＡＡ）含量的变化．结果表明：生长素含量在整个发病期间健株都较高于病株,细胞分裂素含量在发病初期明显高于健株,随后呈下降趋势并趋于稳定,Ｃ／Ａ值在病程中相对处于较高水平．     

云南烟草丛枝症病害研究 ⅩⅥ 网罩隔离培育无毒烟苗防治病害

 云南烟草丛枝症病害是经烟蚜和烟盲蝽传染的病毒病,在 "治虫防病"为主的防治技术的基础上,本文研究网罩隔离技术培养无毒烟苗应用于大田控制病害的方法,并进行一定面积的技术示范工作,结果表明:网罩隔离育苗在田间成功地培育出无毒烟苗,病苗率为0.23%～3.6%,较对照下降约75%～95%,移栽后结合优质烟栽培技术,封顶时烤烟的田间发病率为2～5%,说明以无毒苗应用技术为核心、辅之介体控制和病苗拔除等技术的综合防治体系能够有效和稳定地控制烟草丛枝症病害的危害。     

离体条件下进行治疗枣疯病药物筛选的可行性研究

以婆枣带枣疯病组培苗为试材,在培养基中添加不同浓度及不同次数的盐酸-四环素(TETRACYCLINE,TC)和盐酸-土霉素(OXYTETRACYCLINE,OX)药物,培养40 D后,观察其对病苗生长情况的影响,并对转健苗进行植原体特异PCR检测,结果表明,25ΜG/ML的药物浓度处理一次可使枣疯病症状消失,并完全杀灭枣疯病病原,达到理想效果;同时本研究中田间和组培条件下相同药物治疗效果的一致性进一步说明了利用组织培养技术进行药物筛选的可行性。