猪轮状病毒VP融合蛋白的构建及其免疫原性研究

[目的]研究猪轮状病毒VP8与VP7融合蛋白的免疫原性。[方法]表达和纯化了猪轮状病毒VP8、VP7蛋白与TAT转导肽序列的融合蛋白VP8-VP7-TAT以及VP8-TAT、VP7-TAT。将3种融合蛋白分别经腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠,采集免疫小鼠血液和粪便样品,检测血清特异性抗体Ig G和黏膜特异性抗体Ig A水平;期间观察小鼠体重变化;检测融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿肠功能。[结果]腹腔注射组血清中Ig G抗体水平明显高于其他实验组,但其黏膜Ig A抗体水平较低;灌胃组血清中Ig G抗体水平略低于腹腔注射组,但明显高于对照组。灌胃组能诱导较高水平的黏膜Ig A抗体,高于其他实验组;融合蛋白VP8-VP7-TAT诱导产生的血清中Ig G抗体和黏膜Ig A抗体水平均高于VP8-TAT以及VP7-TAT;在实验周期中,各组小鼠体重均正常;融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿肠活性较好,与对照组之间差异极显著。[结论]融合蛋白VP8-VP7-TAT经口服或注射小鼠后,能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答,并且融合蛋白VP8-VP7-TAT经口服可诱导小鼠机体产生较强的黏膜免疫应答。融合蛋白VP8-VP7-TAT相较VP8-TAT、VP7-TAT,能诱导小鼠机体产生更强的免疫应答,具有更强的免疫原性。融合蛋白VP8-VP7-TAT具有穿肠功能。融合蛋白VP8-VP7-TAT经小鼠安全性实验表明具有很好的安全性。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选猪传染性胸膜肺炎菌体抗原模拟表位

利用猪传染性胸膜肺炎灭活菌苗免疫日本大耳兔得到猪传染性胸膜肺炎抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提IgG后,经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化,以此得到IgG作为配基包被酶标板,对噬菌体随机十二肽库进行3轮不同条件的富集筛选,通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高;随机挑取10个噬菌斑进行扩增,用ELISA检测其免疫活性,结果有6个阳性克隆与纯化的IgG有较强的特异性结合能力;对筛选到的6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并分析其氨基酸序列,其中5个克隆所递呈的序列一致,用Blastp软件进行分析,2种类型的氨基酸序列之间无同源性,且未发现同源性50%以上的序列,提示该短肽可能模拟了猪传染性胸膜肺炎菌体的特异的抗原表位。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位的研究进展

噬菌体随机肽库技术是将编码外源多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白结构基因的表达而表达,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性,是一种基因型与表达型的统一。近年来,噬菌体随机肽库技术被广泛应用于各种抗原的模拟表位筛选中,并取得了显著成果。综述了利用噬菌体随机肽库技术在抗原模拟表位筛选中的研究进展。     

利用噬菌体随机十二肽库筛选生长抑素抗原模拟表位

用生长抑素(somatostatin,SS)疫苗“激生1号”免疫日本大耳兔得到抗血清,经饱和硫酸铵粗提IgG,再经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化后,以此IgG作为筛选配基,对随机十二肽库进行4轮淘洗。随机挑取22个噬菌斑进行双夹心ELISA,结果有6个克隆与SS抗体有较强的特异性结合力,竞争抑制ELISA进一步证明6个克隆有较好的抑制作用。将6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,测序结果中有5个克隆的外源肽序列完全一致,经与SS氨基酸序列比对,发现两者有共同序列FWK,说明5个克隆模拟了生长抑素的抗原表位。     

家蚕生物反应器表达A组轮状病毒结构蛋白VP7

A组轮状病毒(rotavirus,RV)是引起某些幼龄动物患急性胃肠炎的主要病原之一,给家畜养殖业造成严重的经济损失。VP7蛋白是RV最外层的糖蛋白,具有强抗原性和免疫原性。本研究构建了重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP7,并分别感染家蚕细胞、家蚕5龄幼虫以及蚕蛹。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,在重组病毒感染的家蚕细胞、5龄幼虫以及蚕蛹中均检测到35 ku的特异性条带,说明成功表达了VP7蛋白。ELISA检测结果显示,VP7蛋白在家蚕细胞和蚕蛹中的表达分别在感染后第5天和第7天达到最高水平;而在家蚕5龄幼虫中,VP7蛋白表达量不高。家蚕具有食用和药用价值,我们构建的重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP7在家蚕生物反应器中成功表达了VP7蛋白,为A组轮状病毒疫苗的研制提供了一条新途径。     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

[目的]预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位。[方法]综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的抗原表位。[结果]推测B细胞表位位于非洲猪瘟病毒VP73蛋白N端的11~18、26~48、73~82、136~150、159~174、181~1891、91~2102、47~276、279~295、313~323和382~392区段内或上述区段附近。[结论]应用多参数预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位,为今后进一步研究非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特征以及表位疫苗的研制奠定了基础。     

轮状病毒G3血清型抗原蛋白VP7在马铃薯中的表达

采用RT-PCR方法扩增得到轮状病毒外壳蛋白G3VP7基因,其5＇端和3＇端分别与马铃薯Y病毒（PVY）的前导序列和PVY 3＇端的非编码区序列相连接,将拼接好的目的片段克隆到植物表达载体pBI121质粒上,利用三亲融合法将重组质粒转入农杆菌,农杆菌介导转化植株,经PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和ELISA鉴定,确定VP7基因已转入马铃薯基因组,并得以正确表达,为以植物为生物反应器生产口服疫苗奠定了基础.     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由ASF病毒（AS-FV）引起的猪急性、烈性传染病。ASFV可以编码34种以上的结构蛋白。VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,而且抗原性极为稳定,可作为ASFV的主要诊断试剂。笔者利用生物信息学方法,分析了来自Spain 70株的ASFV VP73蛋白的二级结构,并对该蛋白的B细胞表位进行预测,     

兔出血症病毒VP60蛋白T细胞表位优势区的筛选

应用戊二醛醛化的人的“O”型红细胞纯化兔出血症病毒(RHDV),对非免兔进行3次免疫后,经分段表达的重组杆状病毒、纯化的病毒、Con A分别刺激后进行细胞增殖检测、IL-2、IL-4、IFN-γ检测.WST检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,所有重组杆状病毒与空白对照组差异显著；IL-2和IFN-γ检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,其次为2号、4号,而1号、5号重组杆状病毒刺激指数较低,但均高于对照组；IL-4检测结果表明,2号、3号、4号重组杆状病毒刺激的值低于对照组,1号、5号重组杆状病毒刺激组略低于对照组.研究结果表明,重组病毒3号区域为RHDV VP60 T细胞表位的优势区,从而为后期的试验奠定了基础.     

三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的VP6、VP7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。     

昆明鼠对猪轮状病毒核酸免疫的抗体应答

将昆明鼠随机分为A、B两组,分别肌肉注射含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7和真核表达载体pcDNA3.1(+),每只鼠100μg·(100μL)-1,共免疫3次,每次间隔2周。首次免疫第0,14,21,28,35,39,47,54天采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化。A组小鼠血清在首免后第14天即可检出阳性抗体(P/N≥2.0)。     

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL^-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV 亚单位疫苗提供了参考。     

表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析

 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。     

草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价

为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RTPCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,得到重组质粒pETVP7,酶切鉴定后,将pETVP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDSPAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒VP2的原核表达及间接ELISA方法的建立

含有猪细小病毒结果蛋白VP2基因的重组质粒pET32c-VP2,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组VP2蛋白高效表达,以包涵体形式存在,经变、复性和纯化后,Western blot显示有良好的生物活性。纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为3.1μg/mL;血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步定为OD待检血清≥0.4且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1。     

猪源冠状病毒ORF3和ORF7的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株全序列对TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)TS株的ORF3和ORF7各设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增分别获得了1 487 bp和516 bp大小的两个片段,与预期结果大小相符.TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3a核苷酸序列同源性分别为99.1%、93.0%、95.9%、94.4%,相应的氨基酸同源性分别为97.3%、87.8%、93.2%、91.8%,TS株与CHV株、Puedue株、BW021898B株和KT2株的ORF3b核苷酸序列同源性分别为99.5%、98.5%、97.0%、97.8%,相应氨基酸的同源性分别为98.4%、96.3%、94.3%、95.8%,而TS株与PRCVIA1894株的ORF3b核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%和93.9%.TS株ORF7没有发生缺失且和其他毒株有很高的同源性.结果表明:TGEV非结构蛋白高变区在ORF3a第192个碱基至终止密码子之间,TGEV和PRCV在编码ORF3b氨基酸的数量和RNA酶结合位点上有一定的差异.     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1蛋白二级结构及B细胞抗原表位预测

以PPV—N株的VP1蛋白基因序列为材料,采用Chou—Fasman、Garnier—Robson和Karplus—Schultz预测VP1蛋白的二级结构,用Kyte—Doolittle法预测VP1蛋白的亲水性,用Emini法预测VP1蛋白的表面可能性,用Jameson—Wolf法预测VP1蛋白的抗原指数,然后综合分析VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PPV—N株VP1蛋白的二级结构以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。本研究为PPV—N株的自然弱毒分子机理以及反向疫苗学研究提供了一定的理论依据。     

单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定

优化噬菌体展示文库构建策略,获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量进行鉴定.分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)基因,插入T7 select 415-1b噬菌体载体构建文库,计算文库的库容量,测定文库传代稳定性.测序分析VHH基因的多样性和纳米抗体氨基...