关中奶山羊源D型产气荚膜梭菌全基因组序列测定及其分子特征分析

本研究自陕西省富平县某规模化关中奶山羊养殖场腹泻奶山羊肛门拭子中分离到5株产气荚膜梭菌,命名为21-D-1~21-D-5。毒素基因检测表明,其均为携带etx的D型产气荚膜梭菌,且21-D-5携带食源性致病毒素基因cpe。全基因组序列测定显示,5株D型产气荚膜梭菌基因组大小、GC含量和基因数量稳定;单核苷酸多态性（SNPs）分析显示,21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之间的SNPs差异极低（<25）,表明其大概率属于相同的产气荚膜梭菌菌株。分离的D型产气荚膜梭菌基因组中共检测到15种毒素基因,其中,毒素基因etx在分离的D型菌株中高度保守、基因环境相似,且在菌株21-D-5中毒素基因cpe位于etx下游。此外,包括噁唑烷酮类耐药基因optrA在内的9种耐药基因也在分离株中被检测到,并且erm（A）、optrA和fexA具有共同传播的可能性。本研究为国内首次对D型产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定分析,结果对产气荚膜梭菌疾病的防治和基因组的进一步研究具有参考价值。     

牛出血性肠炎A型产气荚膜梭菌的分离鉴定

从新疆维吾尔自治区某牛场采集的3份疑似出血性肠炎病料中分离到8株产气荚膜梭菌,用PCR扩增保守基因16SrRNA,并进行序列测定和同源性分析,再通过多重PCR方法扩增型特异性基因进行分离菌株的分型鉴定。结果显示,所分离的8株产气荚膜梭菌之间16S rRNA基因同源型为100%,与GenBank参比序列同源性在99.8%以上,确定为产气荚膜梭菌。遗传进化分析表明,本次分离的8株产气荚膜梭菌之间拥有共同起源,但与所用的参考菌株分属不同来源。多重PCR扩增结果显示,8株菌株均为产气荚膜梭菌A型。     

携带噁唑烷酮耐药基因optrA藏羊源产气荚膜梭菌的检测

对1株携带有噁唑烷酮类耐药基因oprA的藏羊产气荚膜梭菌QHY-2进行了形态学观察、毒素分型、全基因组测序分析和oprA基因环境分析。结果显示，QHY-2为A型产气荚膜梭菌，对磺胺异噁唑、四环素、氟苯尼考、利奈唑胺和氯霉素等药物具有较强抵抗力。除携带有cpa、pfoA、colA、cloSI、nagH等毒素基因外，还携带有tetA(P)、tet(44)、fexA、optrA、ant(6)-Ib、aac(6′)-aph(2″)、erm(A)、erm(B)和erm(Q)等9种耐药基因。QHY-2的optrA基因环境分析显示，其上、下游分别为耐药基因fexA和erm(A),并与多个参考质粒携带的optrA基因高度相似。首次在藏羊产气荚膜梭菌发现噁唑烷酮类耐药基因oprA,对动物源产气荚膜梭菌的耐药性及噁唑烷酮类药物耐药基因传播趋势评估具有参考价值。     

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。     

产气荚膜梭菌cpe~+菌株的筛选与鉴定

参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因(cpe)设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株C型菌株扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%~100%,推导氨基酸同源性为98.7%~100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。本试验筛选鉴定出1株产气荚膜梭菌cpe+菌株,为今后进一步探讨产气荚膜梭菌性食物中毒机制奠定了基础。     

反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的分离鉴定及分型研究

为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。     

青海玉树牦牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究

无菌采集青海玉树地区牦牛源腹泻粪样,利用常规方法和分子生物学技术对样品中的产气荚膜梭菌进行分离鉴定,通过动物试验、药敏试验、耐药基因检测等方法对分离到的菌株进行了分析。结果显示,从148份样品中成功分离鉴定出牦牛源产气荚膜梭菌14株,其中10株为A型,4株为C型。利用16S rRNA基因序列对部分分离菌系统遗传进化树分析,结果发现,YS-1(MW980090)与印度豹源(MN326666.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性,YS-4(MW980093)和YS-13(MW980102)为单独的一枝,YS-6(MW980095)与北京人源(KP944154.1)产气荚膜梭菌具有相似性。A型菌YS-1(MW980090)和C型菌株YS-6(MW980095)动物试验结果显示,C型产气荚膜梭菌外毒素具有强致死性,A、C型菌具有强致死性。药敏试验结果表明,分离菌对复方新诺明、多黏菌素、青霉素、多西环素、四环素耐药,对克林霉素、氯霉素、万古霉素、氧氟沙星敏感。本研究为预防和治疗因产气荚膜梭菌导致牦牛腹泻等疾病提供用药指导。     

甘肃省牛和羊源产气荚膜梭菌耐药性分析

旨在探究甘肃省牛和羊产气荚膜梭菌的流行情况及对常用抗菌药物的耐药性.对采集自甘肃省不同地区的229份牛、羊源肛拭子进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定,并对分离到的产气荚膜梭菌菌株进行毒素基因检测、最小抑菌浓度(MIC)测定及四环素耐药菌株的同源性分析.结果表明,在229份样品中分离到53株A型产气荚膜梭菌,分离率达23.1％...     

动物源A型产气荚膜梭菌流行情况调查及α毒素基因分析

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%～44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%～100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。     

规模羊场环境气载产气荚膜梭菌耐药性及其ERIC-PCR分型

为监测不同规模羊场空气中分离的气载产气荚膜梭菌耐药性变迁及不同菌株间的遗传相似性,从而为临床治疗和控制感染提供依据,收集了2016—2017年来自不同规模羊场分离的气载产气荚膜梭菌30株,采用K-B法进行药敏试验,应用基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR),对菌株进行DNA分型及同源性分析。结果显示:30株气载产气荚膜梭菌在监测的9种药物中,对庆大霉素的耐药性最强(86.7%),其次为青霉素(43.3%),对头孢噻肟耐药率最低(1%),对其他药物耐药率在3.3%~36.7%之间;ERIC-PCR谱型表现为14个基因型(Ⅰ~XIV),其中大部分来源于不同的克隆株,且有2个克隆株的相似度为99.0%。本研究结果表明:规模羊场的气载产气荚膜梭菌多重耐药较严重,分子多样性复杂;气载产气荚膜梭菌来源广泛,不同地区、环境和条件下,同一种病原菌的基因型也存在一定差异,可能存在多个基因型;同一个规模羊场的基因型也不同,不同羊场之间也存在相同的基因型。     

商品肉鸡梭菌性肠炎的试验诊断

为了对商品肉鸡梭菌性肠炎的发病情况进行调查,本试验对收集的不同养殖模式的具有肠炎症状的肉鸡肠道内容物进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定、活菌计数、菌株毒素类型鉴定以及动物试验,并对其中的43株分离株进行了药敏试验,同时也对不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌进行了16S rRNA基因的同源性分析。结果显示,患病鸡肠道分离到的产气荚膜梭菌均为A型且肠道内容物活菌数量达10~6CFU/g以上;动物试验结果显示,攻毒菌液上清的小鼠在观察期内死亡并表现出明显的坏死性肠炎症状;药敏试验结果表明,不同来源菌株耐药性存在差异;同源性分析发现,不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌无明显宿主特异性。本试验结果可为临床肉鸡梭菌性肠炎的了解及防治提供一定的参考价值。     

规模牛场产气荚膜梭菌耐药性及其ERIC-PCR指纹图谱分型

[目的 ]了解不同规模牛场分离的产气荚膜梭菌耐药性及其耐药基因分型,为临床治疗和感染控制提供依据。[方法 ]收集2014—2016年来自不同规模牛场分离的产气荚膜梭菌25株,采用K-B法检测其对9种常用抗生素的敏感性;应用基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR),对菌株进行DNA分型及同源性分析。[结果]分离到25株产气荚膜梭菌;在耐药检测的9种药物中,耐药率超过50%的有4种,其中对庆大霉素耐药率最高(92%),其次是对青霉素(84%),而对氨苄青霉素耐药率最低(4%),对其余药物的耐药率在12%~52%之间;ERIC-PCR谱型表现为9个基因型(Ⅰ~Ⅸ),其中大部分来源于不同的克隆株,且有2个克隆株的相似度为100%。[结论 ]奶牛场的产气荚膜梭菌多重耐药现象比较严重,分子多样性复杂;产气荚膜梭菌来源广泛,不同地区、环境和条件下,同一种病原菌的基因型存在一定差异,可能存在多个基因型。     

牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】2023年4月至2023年5月，西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象。试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性，以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考。【方法】采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养，通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定；对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定，并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验；采用K-B法测定分离株的体外药物敏感性，统计不同分离株的多重耐药结果。【结果】从样品中分离纯化得到8株分离菌，在厌氧培养基中生长旺盛，在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落，革兰染色为紫色大杆菌，初步判定为产气荚膜梭菌，命名为XZ-1～XZ-8。分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符；分离株均携带cpa和cpb2基因，为A型产气荚膜梭菌；16S rRNA基因分析结果显示，8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%～100%,在系统进化树中处于同一分支，而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支...     

A型产气荚膜梭菌青海分离株tetA(P)耐药基因序列分析及蛋白结构预测

应用PCR技术对A型产气荚膜梭菌青海分离株的tetA(P)耐药基因进行扩增、测序,利用生物软件对tetA(P)基因进行序列分析与蛋白结构预测。结果表明,A型产气荚膜梭菌青海分离株的tetA(P)基因长度为1 263bp,编码420个氨基酸。与参考菌株EHE-NE18、Wakayama、CW92的核苷酸序列同源性依次为100%、99.8%和98.7%,氨基酸序列同源性依次为100%、100%和98.3%。分离株TetA(P)蛋白疏水性较强,具有10个跨膜区,含有4个N-糖基化位点,1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,12个N-豆寇酰化位点,三级结构主要是由α-螺旋和无规则卷曲形成。研究结果可为A型产气荚膜梭菌tetA(P)基因功能研究提供依据。     

1株西藏牦牛巴氏杆菌全基因组测序与比较基因组学分析

为进一步对西藏牦牛巴氏杆菌病基因组学研究提供理论基础,从西藏林芝某地病死牦牛肺脏中分离鉴定出1株荚膜A型牦牛巴氏杆菌,并通过SMRT法对该菌株进行全基因组序列测定,对测序数据组装后基因组组分及比较基因组学进行分析。结果显示,获得大小为2.3 Mb基因组,GC含量40.30%。同时预测2 096个编码基因数量,编码基因序列总长度2 047 410 bp。预测出总长度为4 739 bp的重复序列,重复序列含量0.21%。预测非编码rRNA数量为19、tRNA数量为59。假基因数量为3,假基因总长度为736 bp。此外,对测序的1株菌株和2株参考菌株(Mannheimia haeemolytica、Pasteurella multocica)进行基因组共线性分析,显示测序菌株与参考菌株之间共线性良好。对测序的1株菌株和2株参考菌株进行家族分类,共得到2 105个基因族,其中,3株菌共有的基因族类(核心基因族)有1 483个,占总基因组的70.45%。进化分析研究显示,测序菌株与参考菌株Mannheimia haeemolytica较远。表明本研究对西藏牦牛巴氏杆菌分离菌株进行全基因测序,同时进行基因组组分及比较基因组学分析,为牦牛巴氏杆菌病的进一步研究提供数据支持。     

迁徙候鸟产气荚膜梭菌的分离鉴定与特性分析

产气荚膜梭菌是一种人兽共患病原菌,可通过多种途径感染人类。本研究从迁徙候鸟样品中对产气荚膜梭菌进行分离鉴定,并进行毒力基因检测、分型、生物被膜形成能力鉴定及耐药性测定。结果从549份健康候鸟粪便样品中分离细菌42株,35只死亡候鸟病料样品中分离细菌11株,通过PCR方法共鉴定A型菌48株,E型菌5株,所有菌株均未检出β2毒素、肠毒素和NetB毒素基因,30株经测定能够形成生物膜;分离菌株对黏菌素、杆菌肽、克林霉素和红霉素的耐药率在40%以上,所有菌株均对复方新诺明敏感。结论得出迁徙候鸟携带产气荚膜梭菌的比例较低,但是对部分抗生素的高耐药性值得关注。     

青岛地区兔源产气荚膜梭菌的分离鉴定及遗传多样性分析

兔的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的严重危害养兔业的一种疾病,为了更好地控制此病,本研究调查了青岛地区规模化兔场爆发此病时产气荚膜梭菌的毒素型及遗传多样性。2010年11月-2012年5月期间,采集青岛地区规模化养兔场疑似产气荚膜梭菌感染兔的肝脏进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用Multiple—PCR方法对分离菌株进行毒素型分析,应用ERIC-PCR方法分析分离菌株的遗传多样性。共分离到25株产气荚膜梭菌,其中A型24株（96％）,C型1株（4％）。用ERIC—PCR方法将25株分离株分于9个聚类中,其中V型为主要流行型。结果表明：青岛地区规模化兔场中产气荚膜梭菌流行的毒素型主要为A型,且具有多种基因亚型,其中V型为主要流行型。此结果为该地区兔产气荚膜梭菌病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

规模化养鸡场A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其对海南霉素敏感性的测定

为探究海南霉素对产气荚膜梭菌的敏感性,在某大型养鸡场采集了209份鸡肠道样本,采用选择性培养基和MALDI-TOF质谱仪微生物鉴定仪鉴定,并对鉴定的菌株进行分型。采用琼脂稀释法测定了海南霉素、恩拉霉素、盐霉素、丁酸甘油酯对临床分离的产气荚膜梭菌的抗菌活性,以期为当前限抗禁抗后养殖场选择合适的药物控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验结果表明：共分离出61株产气荚膜梭菌,分离率为29.2%;通过多重PCR对所分离的产气荚膜梭菌进行分型,结果分离株均为A型产气荚膜梭菌;4种药物均有不同程度的抑菌效果,其中海南霉素与恩拉霉素对鸡源产气荚膜梭菌的抑菌效果最好,且MIC值范围均为0.004～0.06μg/mL。海南霉素具有很好的抗梭菌效果。     

牛奶中产气荚膜梭菌的分离鉴定和带菌量测定

调查陕西关中地区牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况及其优势血清型和携带的毒素基因。通过对3个奶牛场采集的86份牛奶样品进行细菌分离纯化,应用多重PCR鉴定分离菌株的血清型,进行cpb2、cpe毒素基因检测,并对场3的乳样按照GB 4789.13-2012规定的方法进行产气荚膜梭菌带菌量的测定。结果显示,个体乳样产气荚膜梭菌的分离率为11.3%(7/62),且全部为A型菌,57.1%(4/7)的分离菌株携带atyp.cpb2基因,但所有分离菌株均未检测到cons.cpb2和cpe基因。而混合乳样(24份)中未分离出目的菌。场3的28份乳样中3份产气荚膜梭菌阳性乳的带菌量为1 CFU/mL～15.3 CFU/mL。初步了解了陕西关中地区生鲜牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况、血清型及其携带的毒素基因,为关中地区牛奶中该菌污染的防控提供科学依据,为该菌引起食物中毒的流行病学研究提供参考资料。     

奶山羊D型产气荚膜梭菌的分离鉴定

为鉴定2018年夏季昆明市某奶山羊场持续发生羊急性死亡原因,从该场采集病料进行细菌分离鉴定、小鼠毒力试验、毒素基因检测及序列分析、16S rDNA序列分析比较和药敏试验。结果显示:引起羊发病的病原菌鉴定为D型产气荚膜梭菌;对其2个毒素基因α、ε及16S rDNA序列分析结果表明,毒素基因及16S rDNA高度保守,不同毒素型的菌株16S rDNA序列100%同源,经BLAST比对的2个毒素基因与参考序列之间核苷酸完全同源;分离株在接种小鼠后48 h死亡,表明其毒力较强;药敏试验结果表明,分离菌对恩诺沙星、青霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、氯霉素等抗生素均高度敏感,而对卡那霉素、庆大霉素和链霉素等耐药。试验结果可为羊产气荚膜梭菌感染的临床用药提供参考。