甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

水稻条纹病毒外壳白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白（CP）的病害特异性蛋白（SP）是两种与症状密切相关的蛋白，本文对我国云南YL分离物的CP基因和SP基因进行了克隆和测序，结果表明，CP基因和SP基因分别由966和534个核苷酸组成，与已发表的一些分离物相比，LY分离物CP基因与我国山东C分离物和日本T，M分离物的核苷酸序列一致性在96．0％左右，氨基酸序列一致性为97．0％，但从序列一致性和碱基变异方式来看，C分离物与T，M分离物的亲缘关系稍近，YL分离物SP基因和云南CX分离物之间有99．0％的核苷酸序列一致性，但与T，M分离物的核苷酸一致性只有94．0％左右，可见，不同分离物间SP基因的变异与基地理分布有密切的关系。     

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein, CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明：KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%～99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%～99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋...     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

赣南柑橘产区衰退病毒外壳蛋白基因初步分析

[目的]对江西赣南柑橘果园感染衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)样品的外壳蛋白(CP)基因进行克隆及序列遗传信息分析,为利用弱毒株交叉保护法预防该地区CTV的蔓延奠定基础.[方法]运用RT-PCR扩增样品的CP基因并测序,应用软件检测CP序列基因重组,分析碱基含量,再将所测序列与10个外国CTV分离株计算核苷酸遗传距离,比对序列同源性及构建系统发育树.[结果]214份柑橘样品中有78份感染了CTV,发病率为36.4％.78个样品中仅有一个存在基因重组现象;78个CTV分离株CP基因全长序列均为672 bp,无碱基缺失、插入等现象,CP基因平均GC含量为52.8％,AT(U)为47.2％;所有样品核苷酸遗传距离在0～0.072,与10个已知CTV分离株CP基因核苷酸遗传距离在0～0.106.78个样品的CP基因核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分别为89.1％～100.0％和92.3％～100.0％,与10株已知CTV分离株的同源性分别为76.5％～98.9％和73.6％～99.5％.系统进化分析结果表明,78个分离样品与10株已知CTV分离株可聚为四大类群,第Ⅰ类群包含49个分离样品和7个症状不同的已知CTV分离株(6个强毒型和1个弱毒型);第Ⅱ类群包含21个样品,国外强毒株系Qaha和引发茎陷点、速衰症状的Mexico-ctv株系聚于此类群;第Ⅲ类群仅由采自瑞金的CRJ14组成;第Ⅳ类群包括一个国外强毒株系HA16-5和采自江口、宁都的样品.[结论]赣南柑橘产区CTV分离株的CP基因保守性较高,序列存在一定程度的变异;各分离株间亲缘性较高但关系复杂,大部分样品与强毒型和茎陷点型分离株相关.     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

水稻条纹病毒安徽分离物CP基因的克隆及序列分析

采集安徽庐江水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA.设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒安徽分离物(RSV-AH)的RNA3部分片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1051个核苷酸,其中包含的CP基因全长969个核苷酸,编码322个氨基酸.将RSV安徽分离物CP基因(AH-CP)与其它来源的RSV CP基因进行核甘酸序列相似性比较,结果表明,安徽庐江的RSV CP基因与江苏洪泽的RSV CP基因序列相似性最高,达99.3%.进一步构建RSV CP基因系统关系树,发现安徽庐江的RSV CP基因同样与江苏洪泽的RSV CP基因亲缘关系最近.     

芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%.     

韭葱黄条病毒六安分离物CP基因原核表达与抗体制备

根据已报道的韭葱黄条病毒(LYSV)序列设计引物,扩增LYSV六安分离物的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的LYSV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测出的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清.Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1:3 700的一抗,可用于田间LYSV病样检测.     

不同来源苹果茎沟病毒分离物部分序列分子特性研究

[目的]明确为害新疆不同品种梨的苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV)侵染状况,并对获得的病毒基因序列进行分子鉴定.[方法]采用生物学和分子生物学方法对来源于新疆梨、砂梨及红梨上的ASGV进行检测,将获得基因序列进行比对分析.[结果]从10份新疆梨、2份砂梨及3份云南红梨样品上扩增到预期大小为500 by的ASGV扩增产物.对扩增产物进行克隆和测序,序列分析的结果显示,15个ASGV分离物的CP基因核昔酸及其编码的氨基酸序列相似性分别为88.2;-100;和95.6;-100;,CP基因核苷酸序列构建系统发育树显示,来源于库尔勒香梨分离物KII-3、KII-5、KII-7和新梨7号的分离物XII-5、XII -6,与早期已报道的库尔勒香梨分离物KRL-1及砂梨分离物P-6-1-17亲缘关系较近,聚集成簇.此外,库尔勒香梨的分离物KII-10、KII-14及新粱7号的分离物XII-10与云南红梨上2个分离物YN-2和YN-4聚集成簇,遗传距离较近.[结论]CP基因核昔酸序列系统发育树显示,来源于新获不同品种梨的8个ASGV 分离物及红梨上3个ASGV分离物位于两个不同的组群,存在复杂遗传变异现象.     

云南昭通苹果产区苹果花叶病毒的鉴定

 研究通过电镜、免疫捕获RT PCR的方法,对云南昭通表现花叶的苹果病样进行鉴定,电镜观察到直径为26～35 nm,无包膜二十面体的准等轴对称病毒颗粒,与苹果花叶病毒（Apple mosaic virus,ApMV）相似。根据苹果花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,提取病毒病样品总RNA,进行扩增、克隆和测序。序列分析表明侵染云南昭通的苹果花叶病病原为ApMV。把本试验鉴定的苹果花叶病毒与已报道的31个苹果花叶病毒分离物进行序列比对和分析。所有的ApMV分离物可以划为3个亚组。其中,亚组Ⅰ、亚组Ⅱ中均有侵染苹果的ApMV分离物。亚组Ⅰ寄主分化较多,亚组Ⅱ多为苹果分离物,而梨分离物单独聚在亚组III。本研究的云南昭通ApMV分离物（ZT）与昆明斗南月季分离物（Kmi2）,美国分离物（NCGR9026）、捷克共和国分离物4个分离物（Cz1,Cz2,Cz3,Cz5）、德国分离物（G1）聚为寄主分化较多的亚组Ⅰ,与昆明斗南月季分离物Kmi2的核苷酸序列同源性最高,相似性达到998%。本研究为研究云南ApMV分子变异、与寄主的互作和指导防控提供依据。     

侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定

1999年秋在杭州一株表现典型黄化花叶的南瓜(Cucuribita moschata)上分离获得一株线状病毒HZ00s1.该病毒分离物在葫芦科作物(Cucuribitaceae)上引起系统症状.经寄主反应测定、病毒形态学和寄主组织病变观察, 初步确定该病毒为小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV).对ZYMV杭州分离物(HZ00s1)的外壳蛋白序列及3 端非编码区进行了克隆及序列测定,并与ZYMV Conneticut分离物、Florida分离物、California分离物以及WMV2 Tonga分离物进行了同源性分析.结果显示:HZ00s1分离物与其它3种ZYMV分离物CP基因核酸序列同源性为93%～94%,而与WMV2 Tonga分离物的同源性仅为67%,来自美国的3种ZYMV分离物之间的同源性高达95%～99%.HZ00s1分离物与其它3个ZYMV分离物CP氨基酸序列同源性在95%～98%之间.因此确定在杭州地区葫芦科作物上有ZYMV的发生.     

ACLSV山东苹果分离物基因重组及CP序列多样性分析

【目的】明确苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）山东苹果分离物全基因组的分子特征、潜在重组事件及CP基因的多样性。【方法】采用RT-PCR分段扩增、克隆、拼接获得ACLSV全基因组序列,对其进行分子特征描述,并与已报道的16条全长基因组或近全长基因组序列进行比较和系统发育分析,同时扩增其CP进行多样性分析。【结果】扩增得到ACLSV山东苹果分离物QD-13全基因组序列（GenBank登录号KJ522693）,QD-13全长7 557 nt,包含3个ORF。构建进化树分析表明,QD-13与日本苹果分离物B6聚为一簇,二者相似性最高,为85.9%。17条ACLSV分离物基因组分段比较表明,5′端和3′端差异较大;ORF3保守性相对较高,除分离物Ta Tao 5和MS外,其推导的氨基酸序列相似性均在91.2%以上。ORF1编码区527-665 aa区域保守性差,所比较的17条序列在该区域的相似性为15.4%-59.7%。基因组重组分析以P≤0.05为标准,3种以上算法同时检测到则为有意义重组事件,结果显示,QD-13存在3个重组事件,它们分别发生在6 507-6 247、6 397-6 497和3 851-4 760 nt。扩增QD-15、QD-20和YT-24分离物ACLSV的CP,共获得22条序列,可分为3种类型。对CP氨基酸序列进行比对分析表明,3种类型为不同氨基酸保守位点的组合,分别是Met⁶⁰-Ser⁷³-Ser⁷⁹-Asp⁸²-Asn⁹⁷-Gly⁹⁸、Leu⁵⁹-Met⁸³-Ile¹⁹³和Ala⁴⁰- Leu⁶⁰-Ala⁷²-Phe⁷⁵-Ile⁸⁶-Arg⁸⁸-Ser¹³⁰-Gly¹³⁷-Met¹⁸⁴。【结论】报道了中国ACLSV苹果分离物的完整基因组序列;明确了其基因组分子特点并发现了3个主要的潜在重组事件;ACLSV山东苹果分离物CP存在3种序列类型,具有丰富的多样性。     

韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)是大蒜上的重要病毒病害,几乎分布于全国所有大蒜种植区域,严重影响大蒜的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的LYSVCP基因的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了LYSV黑龙江分离物(LYSV-HLJ)CP基因全长cDNA序列。结果表明,LYSV-HLJCP基因全长885bp,编码295个氨基酸残基;与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%,氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。依据LYSVCP氨基酸序列建立系统进化树,将LYSV不同分离物划分为4个类群,LYSV-HLJ与韩国和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现出一定的寄主相关性。     

郑州地区小麦黄矮病病原鉴定及其外壳蛋白的分子进化分析

为了明确郑州地区小麦黄矮病病原种类及其分子变异情况,根据已公布的小麦黄矮病致病毒株GAV,GPV和PAV的外壳蛋白(CP)全长基因序列,采用RT-PCR方法鉴定了来自郑州地区的4个分离物种类,并进行了基于CP序列的郑州分离物与6个国内和3个国外分离物的进化关系分析.结果表明,郑州地区的4个分离物均鉴定为BYDV-PAV(命名为PAV-ZZ),其编码的CP与国内及国外的分离物,在核苷酸水平上的一致性为81%～99%.PAV-ZZ CP与济南分离物一致性最高,核苷酸水平上达99%;与昆明和德国、瑞典、美国分离物一致性较低,核苷酸水平上仅为81%.这表明BYDV-PAV郑州分离物与北方地区的病毒分离物可能有着相似的系统进化特征,而与南方地区及国外分离物在系统进化上有较大的差异.     

Genetic Evolution Analysis on Wild Isolates of Citrus Tristeza Virus Originated in China Based on Coat Protein Genes Sequences

The coat protein （CP） genes were cloned and sequenced from viral particles of 11 isolates of citrus tristeza virus （CTV） collected from wild citrus plants in China and 4 Chinese isolates from cultivated sweet orange and pummelo varieties, respectively. By analyzing and comparing the nucleotide and amino acid sequences of CP genes, the 11 wild CTV isolates were found over 92% identical with 4 Chinese CTV isolates and 21 exotic CTV isolates from cultivated citrus. From 91 to 100% of the CTV CP gene sequences in wild type citrus plants were generally well conserved. Genetic evolution analysis indicated that the GC% of the CP gene was less than AT%, and more transition were found in the CP genes than transversion with the transition/transversion ratio ranging from 6.3 to 7.0 among species. The substitution frequency was the highest at the third codon, followed by the first and second codon. The ratio of non-synonymous mutations （du） to synonymous mutations （ds） was far lower than 1, suggesting that the CP gene might have experienced purifying selection in the evolution. Phylogenetic analysis revealed that the 11 CTV isolates in Chinese wild type citrus belonged to different phylogenetic clusters, and shared higher homology and closer relationships with other cultivated citrus CTV isolates from different countries, which indicated complicated genetic relationships among the CTV isolates. In addition, CTV isolates with similar biological characteristics usually located into the same clusters. Therefore, the conclusion was drawn that pathogenicity was critical to evolution and origin of CTV.     

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。