鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。     

桉树的ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB法提取桉树嫩叶总DNA,进行ISSR分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。桉树ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件是:25μL PCR反应体积中,buffer(10 mM Tris-HCl,pH9.0,50 mM KCl,0.1%Triton X-100),1.25 U TaqDNA聚合酶,4种dNTPs各0.2 mM,0.4μM引物,2.0mM MgCl2,50 ng模板DNA。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环:94℃变性45s,52℃~55℃复性45s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min。     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。     

川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较

以川山茶品种茶睡莲为试验材料,以改良CTAB法提取高质量DNA,采用正交设计L16(45),探讨了Mg~(2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对川山茶ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系的影响。建立了相关优化体系:20μL的ISSR-PCR扩增体系中含20 ng模板DNA,2μL10×Buffer,2 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物和1 U TaqDNA聚合酶,扩增退火温度为55℃,35个循环;20μL的SSR-PCR扩增体系中含50 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg~(2+),0.05 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物和0.5 U TaqDNA聚合酶,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为38。应用该优化体系,分别用27个川山茶品种DNA进行了ISSR-PCR扩增和SSR-PCR扩增,结果显示,建立的优化体系具有较高稳定性。     

南酸枣ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以南酸枣叶片基因组DNA为模板,采用单因子实验方法对影响ISSR反应体系的dNTP、Mg2+、引物浓度、模板DNA、Taq酶等5个因子进行优化,结果表明,在20 L ISSR反应体系中,各反应物的最适含量为：2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.25～0.5 mol/L引物、20 ng DNA和0.5 U Taq聚合酶。利用该优化体系扩增85条ISSR引物,有65条有扩增产物,38条具有多态性,并且利用842引物扩增不同南酸枣DNA模板,扩增的目的条带清晰、多态性好、稳定性强,可以用于后期的南酸枣种质资源鉴定及遗传多样性研究。     

仙茅根茎DNA的提取及其ISSR-PCR反应体系的优化

为了改进仙茅基因组DNA的提取方法,从而为其遗传多样性研究提供参考依据,以仙茅根茎为材料,采用CTAB法探讨了仙茅根茎DNA大量提取中CTAB浓度、PVP用量及Na Cl浓度对其DNA质量的影响情况。结果表明,仙茅根茎DNA的大量提取方法的最优组合为:CTAB的浓度为2%,PVP的加入量为0.20 g,Na Cl的浓度为4 mol/L。为了得到仙茅的最佳ISSR-PCR反应体系,以(CT)8 RG为引物,采用单因素实验与正交实验相结合的方法,得到的最优反应体系(25μL)为:1×PCR Buffer,模板DNA浓度为50 ng,Mg2+浓度为2.50 mmol/L,d NTPs浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.50 U。     

细叶桉ISSR-PCR体系的建立与优化

细叶桉是我国近年来成功引种的耐寒桉树种类之一,但其种源关系难以区分,不利于后续新品种的培育.为给后续的分子水平上鉴定细叶桉种源关系打基础,以细叶桉叶片基因组DNA为材料.分析了能够影响细叶桉ISSR-PCR的主要参数如模板DNA、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等6个因素对扩增结果的影响情况,建立了适用于细叶桉ISSR-PCR的反应体系和扩增条件.     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

为建立稳定的红楠ISSR-PCR最佳反应体系,在探索红楠基因组DNA提取的基础上,利用单因子试验和正交试验设计对反应体系进行优化。首先采用单因子试验对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs的不同浓度水平进行优化,找出ISSR-PCR反应各因素的最佳浓度;同时为进一步增加结果的可靠性,采用正交试验设计方法 对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs 4个因素3个浓度水平进行优化和筛选。综合两种试验方法结果,最终获得了红楠ISSR-PCR最佳反应体系:反应体系为20 μL,Taq酶0.05 U·μL^-1,Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1,模板DNA 1 ng·L^-1,dNTPs 0.3 mmol·L^-1,引物(835) 0.5 μmol·L^-1,1×PCR缓冲液。建立重复性好、稳定性优良的ISSR-PCR反应体系,为下一步红楠群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。     

伯乐树ISSR分子标记体系的建立

从浙江省庆元县等地采集23份野生伯乐树单株叶片为试验材料,采用单因素对比试验和正交优化试验研究了模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量,以及Mg~(2+)、dNTP、引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响,建立伯乐树适宜的ISSR-PCR扩增体系,即20μL体系中含90ng模板DNA,1×PCR buffer,1.0mmol/L Mg~(2+),0.15mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物,0.75U Taq DNA聚合酶,退火温度为50℃。     

光皮树无性系ISSR-PCR反应体系的建立

以光皮树基因组DNA为材料,采用单因素实验,测试了退火温度、模板用量、dNTP浓度、Taq酶用量、Primer浓度、Buffer用量和Mg2+浓度等因素对ISSR-PCR的影响.优化的反应体系和条件:总体系为25 μL,引物0.2 μmol/L,模板20 ng、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.5 U、dNTP为0.1 mmol/L和Buffer为2.5 μL.扩增程序:94 C预变性5 min,1个循环;94 C变性50s,52 C退火1 min,72 C延伸1.5 min,40个循环;72C后延伸10min,1个循环.该体系的建立为今后利用ISSR进一步研究光皮树遗传连锁图谱构建、遗传多样性、种质资源鉴定与和基因定位奠定了技术基础.     

澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化

澳洲坚果(Macadamia spp.)属山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia)常绿乔木.原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔士州北部、南纬25°-31°之间的沿海亚热带雨林.     

岷江百合ISSR-PCR反应体系的优化

以岷江百合为材料,对影响ISSR-PCR反应的主要参数进行优化,建立了适用于岷江百合的ISSR-PCR反应体系.20μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.25 mmol/L Mg2 、0.4 mmol/L dNTPs、0.6 μmol/L引物、0.5 U Taq DNA聚合酶、20ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性40 s,52.8℃退火45 s,72℃延伸1min 30s,共45个循环;最后72℃延伸8 min.该优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术开展岷江百合遗传多样性研究奠定了基础.