香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

黄栌枯萎病菌巢式PCR检测方法的建立

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄栌(Cotinus coggygria)枯萎病可造成黄栌大量死亡,严重威胁北京香山公园的红叶景观.建立快速、高灵敏度的黄栌枯萎病菌(V.dahliae)检测技术对于黄栌枯萎病的防治具有重要意义.基于大丽轮枝菌特异性引物P1/P2扩增出的ITS序列设计3对巢...     

合欢枯萎病菌生物学特性研究

以常规方法对合欢枯萎菌的生物学特性进行了研究。结果表明,该病菌可在5-35℃下生长,最适温度为25-30℃：病菌生长的pH值范围为4-10,最适pH值为6-7;病菌可在多种碳、氮源上生长,最佳碳源为蔗糖;菌丝生长和孢子萌发的最佳氮源分别为牛肉膏和氯化铵;病原菌致死温度为70℃。光暗交替有利于孢子萌发。     

马铃薯早疫病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

马铃薯早疫病主要是由茄链格孢(Alternaria solani)引起的一种常见真菌性病害。本试验依据GenBank中链格孢属的ITS序列(Internal Transcribed Spacer),设计并合成了1对特异性引物ptAsQ-F(5′-TTTGCAATGGCAATCAGCG-3′)/ptAs-R(5′-CCCGCAAG-GGGAGACAAA-3′),以重组质粒为标准品构建实时荧光定量标准曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法,引物特异性好,灵敏度高。重复性试验表明,组内和组间变异系数均小于2.51%,显示该方法具有较好的检测稳定性。利用该定量检测技术,可以检测出潜伏侵染于叶片和土壤中的早疫病菌。该方法为马铃薯早疫病田间发病的动态监测以及指导高效防控措施提供了技术支持。     

猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法.应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25 μL反应体系检测灵敏度可达68拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线.结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒.     

草莓枯萎病菌的生物学特性

草莓枯萎病病原为尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporumf.sp.fragariae)。生物学特性研究表明,草莓枯萎病菌在PSA上生长和产孢最好,菌丝生长和产孢的适温为25~30℃,适宜pH 4~6,全光照可促进产孢。对碳源的利用,麦芽糖最好,乳糖最差;对氮源的利用,酵母膏最好,尿素最差。孢子萌发的适温为20~30℃,最适28℃,高于40℃和低于5℃不能萌发,RH在90%~100%均能萌发,在水滴中萌发率最高,低于90%不萌发;萌发最适pH 4~6,高于pH 8不萌发,光照有利于孢子萌发,最适孢子萌发的碳源是乳糖,氮源是牛肉膏。     

实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合症病毒方法的建立

[目的]根据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）的保守序列,利用Primer5.0软件设计引物,建立了WSSV的荧光实时定量PCR检测体系。[方法]构建含有WSSV目扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,探索反应条件。[结果]确定了最佳退火温度（61℃）和最佳引物浓度（0.2μmol/L）,标准品浓度在8.8×1098.8×104个拷贝数之间有典型的＂s＂型扩增曲线,标准曲线中模板拷贝数（X）与Ct值的关系为Ct=-3.597lgX＋42.547,相关系数R2=0.993。[结论]该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）没有扩增反应。     

锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。     

葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物（F-cox-Pv/R-Pv）,建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫芦白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、马铃薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL ^-1,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL ^-1,是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值（Ct）与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R ²=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10 ³—2.4×10 ⁹ copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10 ⁴·e ^{0.084 x},相关系数R ²=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10 ⁴ copies/μL病原菌DNA。 【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。     

西瓜枯萎病菌分离、鉴定及室内毒力测定

从西瓜根腐病病株中分离得到镰刀菌10株,经鉴定分别为尖孢镰刀菌(7株)、串珠镰刀菌(2株)、茄病镰刀菌株(1株).其中尖孢镰刀菌的致病性较强,发病率为88.2％,其他两种菌的发病率较低,分别为28.4％和29.7％.对尖孢镰刀菌进行室内毒力试验,结果表明表明万寿菊杀菌素水乳剂与适乐时具有较好的防治效果.     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

水稻稻瘟病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

依据GenBank中登录的稻瘟病菌28S rDNA保守区域设计合成了对稻瘟病菌特异的TaqMan探针,并对实时荧光PCR各反应条件进行摸索优化,得出水稻稻瘟病菌实时荧光PCR的最佳反应体系.利用该体系对其他侵染水稻常见的病原菌进行特异性检测,结果表明只有稻瘟病菌能检测到荧光信号的增加,检测的灵敏度为0.328pg/μL DNA样品.说明该方法是一种较常规PCR快速、特异性强的方法,并且可有效的用于稻瘟病菌的检测.     

实时荧光定量PCR技术的实验研究

实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。     

检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μl;利用该方法对3份不同的组织样品进行重复性检测,计算出平均循环阈值的标准差分别为0.14、0.14和0.44,变异系数分别为0.01%、0.01%和0.02%,说明该方法具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明,该方法与常规RT-PCR的阳性符合率为100%,但其检测灵敏度较常规RT-PCR约高100倍。     

犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus,CBo V)的PCR检测方法,了解其流行情况。[方法]根据Gen Bank数据库上CBo V的VP2基因序列合成1对引物,建立PCR检测方法,并运用该方法对临床样品进行检测。[结果]特异性试验中,除CBo V有目的条带出现外,犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬传染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、猫瘟热(FDV)等均无条带出现。敏感性试验表明,此检测方法对CBo V的最低检测量为4.806 2 pg/μL。重复性试验表明,多次重复试验结果一致,表明此方法重复性好。425份样品中仅有1份样品扩增出目的条带,经测序比对鉴定为CBo V。初步的流行病学调查结果表明,CBo V在犬中的流行率与感染率极低。[结论]建立的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可重复性强等特点。     

绵羊肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

为研究绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）侵害山羊的组织嗜性、筛选其最佳培养基及建立快速检测方法,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,以Mo Y98株16S rRNA基因重组质粒pMD19 MoFQ为模板,通过优化反应体系构建标准曲线,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因的FQ PCR方法,并对所建方法进行重复性、特异性、敏感性及应用性检测。结果表明,所建Mo 16S rRNA基因检测FQ PCR方法具有较好的重复性、特异性、临床应用性,Mo核酸拷贝最低检出量可至10 μL^-1。该方法不仅可作为Mo临床检测方法,且为后续Mo研究工作提供技术支持。     

CPT-I基因荧光定量PCR检测方法的建立

CPT-ImRNA的表达对研究奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢具有重要作用,CPT-I在肝脏中脂肪酸从细胞浆转移到线粒体过程中起关键作用。本研究应用双标准曲线方法,建立了CPT-I基因的相对荧光定量方法。结果表明,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测CPT-I基因具有较好的效果,为肝细胞CPT-I基因定量分析奠定了基础。