鸡新城疫病毒HB92株生物学特性研究（II）：对热的稳定性及在鸡群中的…

将ＮＤＶＨＢ９２株分别置４℃，２０℃，３７℃条件下保存，每隔一周测定血凝价（ＨＡ）和对鸡胚的感染力（ＥＩＤ５０）结果为毒株为３７℃保存７ｄ，在２０℃至少保存３ｄ，其ＨＡ价和ＥＩＤ５０保持不变，４℃保存６０ｄ效价不变，同时说明了ＨＢ９２疫苗株血凝特性和感染力存在不一致性，该毒株经５６℃水浴处理６ｈ，血凝性和对鸡胚的感染力不变，用ＨＢ９２株对１７日龄雏鸡进行滴鼻，拌料及同居感染免疫，３周后ＮＤＨＩ抗体     

鸡减蛋综合征病毒GC2毒株稳定性测定

将ＥＤＳ７６ＧＣ２毒株接种于１０～１１日龄鸭胚尿囊腔内,连续传至第３０代,分别测定不同代次胚液病毒ＨＡ、ＥＩＤ５０及其免疫原性。结果,该病毒不同代次胚液ＨＡ和ＥＩＤ５０分别在１∶２１５和１０５．０／０．１ｍＬ以上,免疫原性良好,对鸭胚致死性随传代次数增加而减弱,说明该病毒稳定性良好。于－２０℃和－５０℃可分别保存６和１２个月以上。     

应用葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测鸭肝炎病毒的研究

用提纯的鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）免疫家兔制备高免血清，常规方法提取ＩｇＧ，与１％葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）阳性菌悬液混合，以ＰＨ７．２０．２ｍｏｌ／ＬＰＢＳ作缓冲液，制成鸭病毒性肝炎（ＤＶＨ）ＳＰＡ协同凝集试验（ＳＰＡ－ＣｏＡ）诊断试剂，同时制备阴性对照试剂。用ＳＰＡ－ＣｏＡ检测人工感染致死的雏鸭肝脏、含ＤＨＶ强毒的鸭胚液、适应鸡胚的疫苗毒鸡胚尿囊毒的检出率均为１００％。用ＳＰＡ－ＣｏＡ检测强毒时，样品     

用吐温80制备新城疫病毒乳化灭活疫苗

用１０％（Ｗ／Ｖ）吐温８０和０．０５％（Ｖ／Ｖ）福尔马林制备新城疫病毒（ＮＤＶ）水－油－水乳化（ＷＯＷＥ）灭活疫苗，其抗原亚单位平均分子量为３０７ＫＤ，油与水的比例为１：２，乳化的ＮＤＶ可单独应用，也构成ＷＯＷＥ四联疫苗。用４４．７μｌ去污剂处理的ＮＤＶ尿囊液（ＮＤＶ－ＡＦ）为一个剂量的单价苗，用其免疫５周龄商品鸡后７周攻毒，可获完全保护。用１７８．６和８９．３μｌ去污处理的ＮＤＶ－ＡＦ苗接种４周     

猪对传播流行性出血热作用的研究

应用ＩＦＡ和免疫酶染色法（ＩＥＡ）分别对家猪屠宰工人和饲养员及其猪肺组织和血清检测流行性出血热（ＥＨＦ）病毒抗原与抗体（抗－ＥＨＦ），结果屠宰工人和饲养员ＥＨＦ隐性感染率随着工龄和接触时间的增加而上升，呈正相关关系（ｒ＝０．９５；０．９８）。特别是从ＥＨＦ病毒抗原阳性猪的饲养员抗－ＥＨＦ率高达２０％（２／１０），而ＥＨＦ病毒抗原阴性猪饲养员未见感染（０／５０），不同疫区猪带毒率和抗－ＥＨＦ阳性率均     

新城疫病毒D10毒株稳定性及最小免剂量测定

将ＮＤＶＤ１０毒株于鸭胚尿囊腔和绒毛膜两个途径接种传代至５０代，分别测定不同代次胚液病毒ＨＡ，ＥＩＤ５０及免疫原性，结果表明该病毒尿囊腔途径接种也可获得较滴度病毒，不同代次病毒液ＨＡ和ＥＩＤ５０都分别在１：２５６和１０＾８．０／０．１ｍｌ以上免疫原性良好，但鸭胚致性随传代数增加而减轻，１２０小时内死亡率仅说明该病毒稳定性良好，该病毒于－２０℃和－５０℃保存期分别达６个月和１２个月，最小免疫剂量≤亡     

用ELISA检测山羊关节炎脑炎病毒抗体

以差速离心，结合ＳＤＳ处理制备ＥＬＩＳＡ抗原，用含０．０２％ＮａＮ３的碳酸盐缓冲液作抗原包被液，不加任何封闭剂，待测血清以含５％犊牛血清和０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０稀释，检测９２２份山羊血清的ＣＡＥ抗体，并与免疫扩散试验（ＡＧＩＤ）比较，提高检出率约一倍并减少漏检     

提高鸡传染性支气管炎病毒血凝抗原滴度途径及抗原灭活

将７株传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）标准株（Ｍ４１、Ｈ１２０、Ｈｏｌｔｅ、Ｇｒａｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｉｏｗａ６０９和Ｔ株）和６株分离株（ＮＩＢＶ、ＧＩＢＶ、Ｍ、ＳＨ、Ｊ和Ｈ株）分别接种于鸡胚，收获尿囊液，经浓缩后，用魏氏梭菌培养液处理，制备血凝抗原。其中，Ｈ１２０株血凝滴度最高，Ｔ、Ｍ、Ｊ和Ｈ株无血凝性。应用含有不同滴度ＩＢＶ母源抗体的鸡胚增殖病毒制备抗原，效价与用ＳＰＦ鸡胚增殖病毒制备的抗原效价一致。尿囊液经反复冻融后再制备抗原会使血凝价降低。抗原分别用甲醛、高碘酸钠、硼氢化钾和ＳＤＳ灭活，其中甲醛灭活效果最理想。抗原对氯仿敏感，对乙醚稳定。适宜浓度的Ｎａ＋、Ｍｇ２＋可显著提高抗原的血凝性     

间接酶联免疫吸附试验检测禽流感抗体的最佳工作条件

禽流感病毒（ＡＩＶ）感染的鸡胚尿囊液经差速离心后,再经蔗糖密度梯度离心,提纯ＡＩＶ,纯化的ＡＩＶ经ＮＰ４０处理并反复冻融,即为ＡＩＥＬＩＳＡ抗原,用该抗原包被聚苯乙烯微量反应板。将健康鸡ＩｇＧ提纯后免疫兔,制备兔抗鸡ＩｇＧ,用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡ＩｇＧ。确立了间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测禽流感抗体的最适工作条件,即：抗原包被浓度１．９～３．８μｇ／ｍｌ,每孔１００μｌ,４℃冰箱过夜;用含０．５％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的磷酸盐缓冲液,３７℃封闭６０分钟;待检血清最佳稀释度为１８０～１６４０,作用６０分钟;酶标抗体作１２０００稀释,作用６０分钟。根据对５２份ＳＰＦ鸡血清的检测结果制定了判定标准。     

小鼠PVM血清抗体I—ELISA检测法的建立及其应用

对实验小鼠感染小鼠肺炎病毒（ＰＶＭ）用间接酶联免疫吸附试验（Ｉ－ＥＬＩＳＡ）进行检测,其敏感性、特异性、重复性和稳定性的达到满意效果。结果显示,用ＰＶＭ接种ＢＨＫ２１细胞经初、高、超差速离心浓缩制备的抗原,与仙台病毒,小鼠肝炎 呼肠孤病毒３型的免疫小鼠血清抗体不产生交叉反应,阻断抑制率大于５０％;Ｉ－ＥＬＩＳＡ与ＨＩ对５０份小鼠血清检测其阳性检出率分别为３０％和２０％;将制备的检测抗的在－２０℃保     

新城疫病毒D_(10)毒株稳定性及最小免剂量测定

将ＮＤＶＤ１０毒株于鸭胚尿囊腔和绒毛膜两个途径接种传代至５０代,分别测定不同代次胚液病毒ＨＡ、ＥＩＤ５０及免疫原性,结果表明该病毒用尿囊腔途径接种也可获得较高滴度病毒,不同代次病毒液ＨＡ和ＥＩＤ５０都分别在１∶２５６和１０８．０／０１ｍｌ以上,免疫原性良好,但鸭胚致死性随传代次数增加而减轻,１２０小时内死亡率仅说明该病毒稳定性良好。该病毒于－２０℃和－５０℃保存期分别达６和１２个月,最小免疫剂量≤５０００ＥＩＤ５０     

鸡新城疫减蛋综合征异源二联灭活油苗的研究

鸡新城疫（ＮＤ）病毒和减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒混合种接种在１２—１４日龄鹅胚上，在接种后１２０小时收获尿囊液，用０．４％甲醛溶液３７℃２４小时灭活，加入１０号白油，制成鸡新城疫减蛋综合征异源二联苗，经２０余万只鸡试用表明，该苗能有效地控制ＮＤ和ＥＤＳ－７６的发生     

鸡产蛋下降综合症灭活疫苗研究：EDS76—NE4株病毒的培养与鉴定

在对ＥＤＳ７６－ＮＥ４株病毒进行血清学鉴定之后，于鸭胚（ＤＥ）、鸭胚成纤维细胞（ＤＥＦ）、鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和鸡胚肝细胞（ＥＣＬ）上适应培养。结果表明，ＥＤＳ７６－ＮＥ４株病毒为鸡产蛋下降综合症病毒，该病毒能在ＤＥ、ＤＥＦ、ＣＥＬ上增殖，在ＤＥ上增殖，尿囊液的血凝价（ＨＡ）可达１：２０４８０－１：３２７６８０倍。     

琼脂凝胶扩散试验检测鸡传染性支气管炎抗体

本文对鸡传染性支气管炎琼脂凝胶扩散试验进行了研究。试验结果表明，感染鸡传染性支气管炎病毒的鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液都能用于制备琼扩抗原，而且以感染ＩＢＶ后２０－３０小时的绒毛尿囊膜和感染ＩＢＶ后４８－６０小时的尿囊液效果最佳。通过传染性支气管炎琼脂凝胶扩散试验的研究和对血清样品的测定，以及与美国ＫＰＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ的ＩＢＶ－ＥＬＩＳＡ诊断盒比较，表明所建立的琼脂凝胶扩散试验可用于鸡传染性支气     

应用Dot—ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

用差速离心结合琼脂糖凝胶层析纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）制备抗原免疫兔,获得高效价的多克隆免疫血清,提纯ＩｇＧ后用辣根过氧化物酶标记,建立了检测ＩＢＶ的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）方法。对影响本方法因素的研究表明,当酶标抗体作１：１００稀释、工作时间为３７℃、６０ｍｉｎ时结果最理想;对待检组织用氯仿处理、对硝酸纤维素膜用０．３％Ｈ２Ｏ２处理３０ｍｉｎ可有效地消除组织内过氧化物酶的影响。该方法具有较强的特异性和敏感性,对病毒的最低检出量为０．０１２４ｍｇ／ｍＬ。本法不仅可检测到纯化ＩＢＶ,而且可直接用于检测鸡胚尿囊液或病变组织（如气管、肾）中的病毒;对临床上疑似ＩＢＶ感染的病鸡的阳性检出率达７８．６％,而病毒分离率仅达６０％,两者符合率为９０％。试验结果表明,Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ可作为ＩＢＶ早期诊断的方法,具有简单、快速、样品用量少等优点。     

非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究

用带有编码非洲猪瘟病毒衣壳蛋白Ｐ７２ 基因的重组杆状病毒（Ｂａｃｐ７２）作载体,在ｓｆ９细胞中表达并得到重组Ｐ７２蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可得到分子量在 ７２ｋＤａ左右的电泳带。用标准阳性非洲猪瘟血清对 Ｐ７２蛋白进行 ＥＬＩＳＡ检测,证明该蛋白具有生物学活性。用Ｐ７２作为间接法的包被抗原,对ＥＬＩＳＡ反应条件进行了优化。确定最佳包被液为ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、最佳封闭液为１％ＰＣＴ、最佳血清稀释液为４％ＰＥＧ６０００／ＰＢＳ、最佳冲洗液为０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）。本实验反应体系采用５０μｌ的微量法,可节约试剂及抗原。反应在２小时内即可完成,达到了快速诊断的目的。包被了抗原并用封闭液封闭后的酶标板密封后保存于－２０℃的冰箱中,至少可以保存５个月。阻断试验和交叉试验表明ＥＬＩＳＡ法有良好的特异性。间接ＥＬＩＳＡ比Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有更高的灵敏性。血清学调查没有得到阳性结果,与我国实际情况相符。用Ｂａｃｐ７２表达的非洲猪瘟病毒Ｐ７２蛋白抗原作为间接ＥＬＩＳＡ的检测抗原来检测非洲猪瘟血清具有快速、简单、无感染的特点。本实验为非洲猪瘟ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的最终组装提供了实验依据。     

鸡新城疫、产蛋下降综合征二联油佐剂灭活疫苗的研制

１　材料和方法　１１　抗原制备　分别将ＮＤＬａｓｏｔａ株和ＥＤＳ７６种毒接种９～１１日龄鸡胚、鸭胚增殖病毒,收获感染胚液,经检测血凝价（ＨＡ）ＮＤ为≥１∶６４０,ＥＤＳ７６≥１∶２０４８０,病毒含量以尿囊腔内注射的感染量≥１０６０ＥＩＤ５０／０１ｍｌ时,可用于制苗用毒,经甲醛溶液３７°Ｃ灭活备用。１２　油相制备　取１０号白油,司本８０按一定比例混合后加硬脂酸铝少量,随加随搅拌,煮沸至透明为止,高压灭菌后备用。１３　水相制备　将灭活的Ｌａｓｏｔａ．ＥＤＳ７６尿囊液按一定比例混匀后,加入吐…     

鸡产蛋下降综合症灭活疫苗研究──EDS_（76）—NE_（4）株病毒的培养与鉴

在对ＥＤＳ７６－ＮＥ４株病毒进行血清学鉴定之后，于鸭胚（ＤＥ）、鸭胚成纤维细胞（ＤＥＦ）、鸡胚（ＣＥ）、鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）和鸡胚肝细胞（ＣＥＬ）上适应培养。结果表明，ＥＤＳ７６－ＮＥ４株病毒为鸡产蛋下降综合症病毒，该病毒能在ＤＥ、ＤＥＦ、ＣＥＬ上增殖，在ＤＥ上增殖，尿囊液的血凝价（ＨＡ）可达１∶２０４８０─１∶３２７６８０倍。     

对EDS－76病毒快速检测方法的研究

用平板红细胞凝集（ＨＡ）试验对鸡产蛋下降综合症（ＥＤＳ－７６）病毒进行了快速定性检测，并与微量ＨＡ试验进行了对比。结果表明，当病毒ＨＡ滴度在５×２１２及其以上时，在１０～２５℃范围内于半分钟可与１０％鸡红细胞（ＲＤＣ）发生极明显的大片凝集。当病毒ＨＡ滴度在５×２１０以下时，则凝集片明显较小，且反应时间在２分钟以上。这种凝集现象可被ＥＤＨ－７６阳性血清特异性抑制。此法可用于对大批量样品中高效价病毒，特别是种毒的初步选筛。     

减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组

采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒,其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性,６５℃复性后,用钙离子介导法,共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞,转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。