新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定

本试验取新生24 h内的Wistar大鼠心肌组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果于培养后48 h即可观察到部分细胞搏动;72 h后,细胞逐渐展开,搏动频率在60~70次/min,从而初步确立培养的细胞为心肌细胞;进一步采用心肌细胞特异性蛋白(cTnT)抗体和α肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体分别对培养的心肌细胞进行免疫荧光及免疫组织化学鉴定,结果均呈阳性。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外分离培养和纯化

星形胶质细胞是胶质细胞中数量最多、分布最片的细胞亚群，担负着胶质细胞的大部分功能，参与多种神经系统疾病病理过程。研究星形胶质细胞的反应对阐明动物多种神经系统疾病的病理发生和分子作用机制具有重要意义。但星形胶质细胞在体内与其他细胞混杂在一起，研究其病理性反应，必须对其进行分离和纯化，     

雏鸡心肌细胞分离及原代培养

为探讨雏鸡心肌细胞的分离、培养方法,采用胶原酶重复多次消化心肌组织,收集每次消化的上清液用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,离心沉淀细胞后再加入培养基混悬细胞.采用差速贴壁法和化学法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育,并对培养的心肌细胞进行免疫组化鉴定.结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12～24 h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3～4 d后形成细胞簇,5～7 d后细胞汇合成片.免疫组化结果表明α-SA抗原表达阳性,证明培养的细胞为心肌细胞,应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的雏鸡心肌细胞.     

家兔睾丸间质细胞的分离纯化及原代培养

为了研究家兔睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)的分离纯化程序及体外生长特点,试验采用4种不同消化程序对家兔睾丸组织进行消化,percoll梯度分离出兔LC,并进行体外培养。结果表明:经4℃保存和34℃孵育,0.5mg/mLⅠ型胶原酶消化40min获得的细胞数最多,经percoll梯度分离的细胞纯度达92%;34℃、5%CO2条件下细胞生长良好,呈现梭形和不规则形2种形状。     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25cm^2的培养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明：经1：3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后 用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25 cm2的培 养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明:经1:3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持 细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

山羊生精上皮细胞分离研究

采用四种酶法分离二月龄关中奶山羊生精上皮细胞,A组:胶原酶Ⅳ;B组:胶原酶Ⅳ +透明质酸酶;C组:胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶与EDTA;D组:胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶与EDTA+DnaseI。结果二月龄羔羊曲细精管主要包含Sertoli细胞、精原细胞和管周排列的肌样细胞。每 200mg睾丸实质收获生精上皮细胞总数 (×105 )A,B,C,D组分别为 6. 91±0. 68, 6. 67±0. 80, 5. 94±0. 81, 5. 74±0. 82;细胞存活率 (% )分别为 76. 82±3. 80, 75. 96±1. 61, 94. 19±2. 89, 92. 32±1. 97;圆形细胞比率 (% )分别为 17. 54±1. 68, 16. 70±1. 46, 23. 64±1. 72, 22. 90±2. 38;细胞贴壁率(% )分别为 5. 93±0. 36, 5. 81±0. 54, 26. 94±1. 54, 25. 00±1. 74。C,D组不但组织块解离效果及细胞离散程度均较A,B好,且原代培养细胞团块数少。多重比较C,D组显著优于A,B组 (P<0.05);C组与D组差异不显著(P>0.05),但与A,B组比较细胞存活率、圆形细胞比率及贴壁率差异极显著(P<0.01)。结论认为C组是较简单有效的山羊生精上皮细胞分离酶组合。     

大鼠子宫蜕膜基质细胞的体外培养试验

为摸索大鼠蜕膜细胞的培养方法,采用胰蛋白酶消化蜕膜组织,全组分蜕膜细胞培养,传代提纯蜕膜基质细胞,在4孔细胞培养板中直接进行泌乳素(PRL)免疫细胞化学检测培养细胞的组成.所采用的方法具有耗时少、细胞活率高的优点.结果:实验方法简单、经济、实用.     

大鼠原代肝脏细胞的分离培养及其膜受体鉴定

本研究采用改良的两步胶原酶灌流法分离培养大鼠肝脏细胞,并对其进行了形态学观察、功能检测及表面受体的鉴定,以探索其短期培养的最佳功能状态。结果表明,平均每只大鼠可获取2.12×10⁸个肝脏细胞,平均活率达94.23%;光镜下观察发现肝脏细胞呈多角形并成片生长;对肝脏细胞的LDH、Alb和尿素进行连续检测,结果发现细胞离体培养第3天功能较好;Mab263-PE单抗鉴定结果显示,肝脏细胞生长激素受体功能健全尚未受损,为细胞信号转导等相关试验奠定了基础。     

睾丸支持细胞的功能、分离纯化及鉴定研究进展

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培养高纯度支持细胞可成为研究睾丸两大核心功能-精子发生和性激素分泌功能相关调节机制重要的细胞模型。此外,体外培养睾丸支持细胞也可作为生殖毒理学等新兴热点领域的细胞模型,为评估和研究环境因素对雄性生殖的影响提供便利。因此,作者系统地归纳、总结了目前关于动物支持细胞生物功能的研究及常用的体外分离纯化、培养及鉴定方法,以期为利用动物支持细胞开展雄性生殖领域的研究提供参考。     

大鼠原代肝细胞的分离与培养

体外培养的大鼠原代肝细胞是研究药物代谢的有效手段,亦是细胞生物学和分子生物学的必需技术。常用的肝细胞分离方法有机械法和酶法。采用何种方法能够获取产率高、活性好、功能强的肝细胞,对于进一步的试验研究十分必要。随着科技的发展,肝细胞分离和培养技术在不断改进。在前     

镉对原代培养大鼠肝细胞的损伤作用

用活体肝脏灌注、胶原酶消化法分离大鼠肝细胞并作原代培养,以CdCl2(0～250或500umol/L）处理,测定培养上清液中LDH、ALT、ARG和细胞内GSH-Px、GSH、MDA等的含量,探讨镉对肝细胞的损伤作用和脂质过氧化状况。结果当Cd≥10和5umol/L时,细胞内LDH、ARG泄漏分别明显增加,GSH-Px活力显著受到抑制,GSH含量和MDA产生随着镉的剂量增大而增加（Cd≥50 umol/L）。认为镉对肝细胞的损伤和对细胞膜完整性的破坏,与脂质过氧化有关;镉处理后细胞中GSH增加可能与镉抑制了还原型谷胱甘肽向氧化型谷胱甘肽的转化有关。镉可直接抑制ALT本身的活性,因而认为以细胞内ALT泄漏作为镉诱导细胞损伤的评价指标时要予以注意。     

绿原酸的提取与分离纯化方法研究进展

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸(鸡纳酸)组成的缩酚酸,异名为咖啡鞣酸,化学名为3-O-咖啡酰奎尼酸,是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[1],具有利胆、抗菌、降压、增加白细胞及兴奋中枢神经系统,抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理作用,对消化系统、血液系统和生殖系统疾病均有显著疗效,对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌有显著的抑制作用。高纯度的绿原酸价格昂贵,是目前国际公认的“植物黄金”。因此,绿原酸的提取和纯化受到国内外学者的普遍关注。1绿原酸的提取方法1.1水提法水提法是利用绿原…     

原代牛肝细胞分离和培养方法的建立

采用胶原酶灌注消化法,对来自新生小牛血清制备厂的牛肝脏尾状突材料进行肝细胞分离,用台盼蓝拒染法测定总细胞数和肝细胞即时存活率,以每孔1×106个肝细胞的量接种于牛尾胶原包被的6孔细胞培养板,进行单层培养细胞形态学观察和培养基上清液LDH活性测定.结果显示,每头小牛肝脏尾状突分离获得的细胞产量为(3.558±0.096)×108个,肝细胞即时存活率为(84.46±3.56)%,培养24～72 h的肝细胞生长状态最好,适合用于有关肝细胞代谢、中毒、基因表达的研究.     

青海湖裸鲤体外心肌细胞原代与传代培养的研究

为了弥补青海湖裸鲤心肌组织细胞离体培养研究的空白,采用组织块移植培养技术, 分别用DMEM培养基和RPMI 1640培养基对青海湖裸鲤心肌组织进行原代培养.培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕;培养1周可见有单层细胞长成.原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后传代培养至第4代.初步确立青海湖裸鲤心肌细胞培养条件为:培养基RPMI 1640,培养温度27 ℃, pH值7.0～7.5,原代培养血清浓度为20%,传代培养血清浓度为10%,无需通入CO2.     

鸡肠上皮细胞的分离及原代培养方法

取18日龄鸡胚，研究鸡肠上皮细胞（IEC）分离及原代培养的方法。结果表明：较好的分离条件是肠组织经0.1g／L中性蛋白酶和300U／mL胶原酶Ⅺ联合消化；较佳的培养条件是细胞在含2．5％～5％胎牛血清的DMEM培养基中，39℃、5％～7．5％CO2下培养，IEC可在1～2d贴壁，6～7d明显增殖，11～12d汇合成片。     

大鼠表皮干细胞的分离培养

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞(ESCs)的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线.结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代～4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好.     

绿豆芽中SOD的分离纯化研究

采用硫酸铵盐析,透析,抽真空,DEAE-纤维素A-52柱层析,从绿豆芽中提纯了超氧化物歧化酶,酶的纯 化程度达到每毫克蛋白2 855U,总酶活回收率为38.4％,纯化倍数为27.5。     

成年公兔睾丸支持细胞的分离纯化及鉴定

为了寻求一种从成年公兔睾丸获得大量高纯度、高活率支持细胞的方法，本试验采用了胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶联合消化法，从成年公兔生精小管分离出支持细胞，通过Tris-HCl低渗处理和选择性贴壁培养对所得的支持细胞进行纯化，并采用形态学和HE染色鉴定。最终获得了大量较高纯度（78.3%）和高活率(90.7%)的支持细胞。     

绿豆芽中SOD的分离纯化研究

采用硫酸铵盐析,透析,抽真空,DEAE-纤维素A-52柱层析,从绿豆芽中提纯了超氧化物歧化酶,酶的纯化程度达到每毫克蛋白2 855U,总酶活回收率为38.4%,纯化倍数为27.5.