镉对体外培养大鼠肝细胞DNA甲基化的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,用醋酸镉进行处理,用免疫荧光法检测了基因组DNA甲基化水平,用偏重亚硫酸氢盐测序法检测了MT、p53和Line1基因的DNA甲基化水平,用qRT-PCR检测了DNMTs基因的mRNA水平。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中基因组DNA甲基化水平具有缓慢下降的趋势,镉处理加速了这种下降的趋势;但p53、MT和Line1基因的DNA甲基化均未受镉的影响;维持DNA甲基化稳定的DNMTs表达水平受镉的影响呈现下降的趋势。表明镉对肝细胞的损害作用可能是通过降低DNMTs的表达水平,进而破坏基因组DNA甲基化的稳定来完成的;而镉对MT表达水平的影响似乎并非通过DNA甲基化途径来完成,因为在镉处理之前MT的DNA甲基化就已经处在较低的水平。     

DNA甲基化在奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎中的调控

旨在研究CSN1S1基因启动子区上游STAT5结合区域的DNA甲基化在奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎中的变化及其对CSN1S1基因表达的调控.本研究利用亚硫酸氢盐修饰和荧光定量PCR法检测受金黄色葡萄球菌侵染后12、24、36和196 h乳腺组织CSN1S1基因启动子区上游甲基化程度及CSN1S1基因表达量.结果,24 h内在细菌侵染的乳腺组织中甲基化程度随着时间的延长而增加；而CSN1S1基因表达量则显著降低(P＜0.01),而在侵染后36和196 h,甲基化程度和基因表达水平与24 h无显著差异.结果表明,奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎能够促使乳腺组织DNA再甲基化,DNA再甲基化可能是奶牛乳房炎急性期的一种普遍调控.     

冷冻保存对猪耳成纤维细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化和基因表达的影响

为探索冷冻保存对猪体细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响,本研究以梅山猪耳成纤维细胞为材料,采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术,检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量,并对甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果表明:冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率极显著高于新鲜组(P0.01),H19基因DMR2表现为去甲基化,极显著低于新鲜组中的甲基化率(P0.01),且该基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01);冷冻组IGF2R基因DMR2表现为超甲基化,冷冻组极显著高于新鲜组中的甲基化率(P0.01),但IGF2R基因表达量无显著差异(P0.05);冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01),DNMT3B基因表达量则无显著差异(P0.05)。本实验条件下,冷冻保存影响了H19和IGF2R基因甲基化控制区的DNA甲基化状态,从而影响了该基因的表达水平。     

苏博美利奴羊皮肤组织中WNT2基因的DNA甲基化与表达量分析

毛囊是皮肤的衍生物,WNT信号通路是已知与毛囊发育密切相关的通路之一,为研究WNT信号通路中关键基因WNT2的DNA甲基化和基因表达对羊毛性状的调控作用,本研究以周岁苏博美利奴羊为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序法(BSP),并结合前期MeDIP-seq结果检测了WNT2基因在第5外显子及前后100bp处的DNA甲基化模式,通过实时荧光定量PCR法检测WNT2基因在苏博美利奴羊皮肤组织中的表达量。结果显示:WNT2基因在2组中的甲基化水平均较高,且2组的表达水平与DNA甲基化水平变化趋势一致,同时,CpG11位点的甲基化水平与表达量之间呈现显著正相关,该位点可能与羊毛纤维直径有关,表明WNT2基因的DNA甲基化水平对羊毛纤维直径有一定作用。本实验为后期深入研究DNA甲基化对毛囊的影响提供了重要参考,也为该基因的进一步研究提供理论基础。     

蒙古羊Hoxc8基因甲基化与胸椎数量的关系

为了研究蒙古羊Hoxc8基因的甲基化与胸椎数的关系,试验采用亚硫酸氢盐测序PCR方法进行检测.结果表明:蒙古羊的14枚胸椎个体(T14)占26.1%,7枚腰椎个体(L7)占69.5%,其中Hoxe8 exon-1含27个CpG.T13型个体的甲基化CpG分别为6,3,6;T14型个体的甲基化CpG分别为23,20,21...     

克隆猪印迹基因IGF2/H19印迹控制区的甲基化状态

为了探求核移植过程中DNA甲基化重编程是否充分,运用亚硫酸氢盐测序法分别检测新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中IGF2/H19基因印迹控制区(DMR1、DMR2、DMR3)的甲基化状态。结果发现,DMR1、DMR3在克隆猪和正常猪各组织中的甲基化水平不同,但差异不显著(P＞0.05)。DMR2在克隆猪肺脏组织表现为超甲基化,极显著高于正常猪(P＜0.01),且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点(分别为4－9位和12－17位),而在其它组织中甲基化差异不显著(P＞0.05)。说明DMR2在克隆猪肺脏组织可能存在DNA甲基化重编程紊乱,这也可能是导致该克隆猪死亡的因素之一。     

初情期启动过程中小尾寒羊下丘脑KiSS-1基因甲基化状态与表达量相互关系

KiSS-1基因在雌性动物初情期启动中扮演着重要作用,其启动子区甲基化状态与KiSS-1mRNA表达量之间关系尚不清楚。本试验利用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)技术和荧光定量PCR技术研究了小尾寒羊初情期前、临近初情期和初情期母羊下丘脑KiSS-1基因启动子区甲基化状态和KiSS-1基因mRNA表达量,分析两者之间的关系。结果表明:随着初情期的启动,KiSS-1基因启动子区甲基化水平显著降低,尤其是在启动子区-501位点降低最明显,并且KiSS-1基因mRNA表达量随着初情期的启动显著升高。结果提示:初情期的启动可能通过降低下丘脑KiSS-1基因启动子区特定位点甲基化水平,从而提高KiSS-1基因mRNA表达量。     

乌珠穆沁羊生长分化因子11基因外显子1序列CpG位点的甲基化模式分析

为了探讨乌珠穆沁羊生长分化因子11 (growth differentiation factor 11,GDF11)基因外显子1的甲基化模式,本研究采用亚硫酸氢盐测序PCR (BSP)的方法对普通乌珠穆沁羊和多脊椎乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1的甲基化水平进行检测,通过检测发现普通乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1的平均甲基化率为0.123,多脊椎乌珠穆沁羊的平均甲基化率为0.569,差异显著性检验表明这两组数据间差异极显著(P<0.01),即多脊椎乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1中的CpG甲基化率极显著高于普通乌珠穆沁羊(P<0.01).通过分析GDF11基因外显子1的13个CpGs位点发现,多脊椎乌珠穆沁羊CpG_11和CpG_13位点的甲基化率值最高,达到90%,推测这两个位点的甲基化可能与乌珠穆沁羊的脊椎数增加有关,是导致多脊椎发生的主要原因.     

潜伏感染期猪伪狂犬病病毒基因组甲基化预测及图谱测定

为研究DNA甲基化在PRV潜伏感染中的作用,本研究首先对PRV全基因组甲基化状态进行预测,再采用亚硫酸氢盐PCR测序的方法检测急性期及潜伏感染期IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域的甲基化状态。结果显示,急性期及潜伏感染期IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域均存在散在的甲基化位点,并未发现广泛的甲基化区域,与预测结果一致。结果表明,潜伏感染期间PRV基因组发生甲基化的可能性很小,进而可知DNA甲基化在PRV潜伏感染过程中未起到关键的作用。     

ASCL2基因在体细胞克隆牛和自然繁殖牛肺脏中的甲基化分析

为探讨ASCL2基因在体细胞克隆牛中的重编程状态,本研究通过亚硫酸氢盐测序法（BSP）对体细胞克隆牛和自然繁殖牛肺脏中ASCL2基因启动子区CpG岛上的CpG位点进行了甲基化状态分析。结果显示,体细胞克隆牛的甲基化水平（28.41%）显著高于正常对照组（7.62%）（P＜0.05）。推测ASCL2基因的异常甲基化可能是造成体细胞克隆牛新生死亡及肺脏发育异常的原因之一。     

新疆巴什拜羊肌肉生长抑制素基因DNA甲基化与mRNA表达量分析

为了探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因在肌肉和脂肪中的DNA甲基化模式及mRNA表达水平,试验以5月龄巴什拜羊羔羊为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测MSTN基因启动子区和第1外显子甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测MSTN基因在巴什拜羊股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂中的mRNA表达水平。结果显示,肌肉组织甲基化概率高于脂肪组织,其中,股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂的甲基化概率分别为74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%,MSTN基因在股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌中的表达水平显著低于尾脂（P < 0.05）,股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌之间差异不显著（P > 0.05）,巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因DNA甲基化水平与MSTN基因表达量呈显著负相关（r=－0.886,P < 0.05）。     

蒙古羊Hoxc8基因甲基化与胸椎数量的关系

为了研究蒙古羊Hoxc8基因的甲基化与胸椎数的关系,试验采用亚硫酸氢盐测序PCR方法进行检测。结果表明:蒙古羊的14枚胸椎个体(T14)占26.1%,7枚腰椎个体(L7)占69.5%,其中Hoxc8 exon-1含27个CpG。T13型个体的甲基化CpG分别为6,3,6;T14型个体的甲基化CpG分别为23,20,21。T13和T14的甲基化比例平均值分别为(18.500±0.064)%和(79.030±0.056)%(P=0.002)。T14蒙古羊Hoxc8 exon-1的甲基化功能区(120～142个碱基)的CpG胞嘧啶全部甲基化,而T13则相反。说明蒙古羊Hoxc8 exon-1甲基化CpG的密度和数量影响Hoxc8基因的表达,并且调控胸椎的发育。     

陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

绵羊Cdkn1c的DNA甲基化分析

为了探究绵羊Cdkn1c的甲基化状态,本研究对绵羊及其它3个物种的Cdkn1c mRNA序列进行了生物信息学分析,并通过亚硫酸氢盐测序法（BSP）对新生羔羊肾脏和肺脏Cdkn1c CpG岛上的CpG位点进行了甲基化分析。结果显示,整个编码区富含CG,为CpG岛;绵羊Cdkn1c所有分析位点均非甲基化,暗示该区域并非差异甲基化区域(DMR)。     

苏太断奶仔猪TAP1基因启动子区甲基化修饰与F18大肠杆菌抗性的关系

本试验运用亚硫酸氢盐(BSP)+Miseq测序法分析苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织TAP1基因启动子区的甲基化水平,并运用real-time PCR(RT-PCR)方法检测TAP1的m RNA表达量,进而分析TAP1基因启动子区甲基化修饰对m RNA表达的影响,探讨TAP1基因启动子区甲基化修饰对F18大肠杆菌抗性的调控作用。结果表明:TAP1基因启动子区2个Cp G岛及其中间区域内存在28个Cp G位点,且都存在不同程度的甲基化;其中在Cp G-6位点,抗性型个体空肠组织中的甲基化水平显著低于敏感型个体的甲基化水平(P0.05);在Cp G-7和Cp G-8位点,抗性型个体十二指肠组织中的甲基化水平显著高于敏感型个体的甲基化水平(P0.05);Cp G-7和Cp G-8位点甲基化水平与TAP1基因m RNA表达量呈负相关。本实验结果显示,Cp G-6、Cp G-7和Cp G-8是调控基因转录水平的关键性位点,断奶仔猪可能通过对TAP1基因启动子区Cp G岛这些关键位点的去甲基化来提高十二指肠和空肠组织中m RNA的表达水平,进而发挥对E.coli F18抗性的调控作用。     

H19和IGF2R基因在体细胞克隆猪各组织中的甲基化状态

为了探求新生克隆猪可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重编程,本试验运用亚硫酸氢盐测序法分别检测了H19基因和IGF2R基因差异甲基化区（DMR）在新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的甲基化状态。结果发现,H19基因DMR在克隆猪肺脏中表现为超甲基化,极显著高于正常猪（95．20％VS46．80％P〈0．01）,且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点（4-9位、12-S17位）,而在其他组织中甲基化差异不显著（P〉0．05）;IGF2R基因DMR在肝脏中处于超甲基化状态,显著高于正常猪（80．00％V839．41％P〈0．05）,而在肺脏中为去甲基化状态,板显著低于正常猪（14．71％VS66．47％P〈0．01）,在其他组织差异不显著（P〉0．05）。结果说明,在死亡克隆猪中,H19基因DMR在肺脏和IGF2R基因在肝脏与肺脏中存在不完全的DNA甲基化重编程,这可能是导致克隆动物死亡的因素之一。     

克隆山羊成纤维细胞IGF2-H19基因座甲基化分析

旨在研究山羊体细胞核移植对克隆后代成纤维细胞IGF2-H19基因座甲基化的影响。以奶山羊耳成纤维细胞(GFC,对照组)和克隆山羊耳成纤维细胞(CFC,试验组)为试验材料,培养至第5代时,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR分析基因的表达差异,亚硫酸氢盐测序(BSP)分析差异甲基化区域的甲基化水平。结果显示,GFC和CFC组细胞的生长曲线均呈典型"S"型,但CFC组细胞的凋亡率显著高于GFC组(P0.01);CFC组细胞中Dnmt1(P0.01)、Dnmt3b(P0.01)、Tet1(P0.05)、Tet2(P0.05)、H19(P0.05)和IGF2(P0.01)基因表达水平均显著低于GFC组,而Tet3、Dnmt3a和IGF2R在2组间无显著性差异;CFC组细胞中IGF2两个差异甲基化区域(DMR1和DMR2)的甲基化水平均显著低于GFC组(74.1%vs.57.8%,P0.01;76.8%vs.40.0%,P0.01),但IGF2-H19印记基因控制区域甲基化水平显著高于GFC组(68.8%vs.84.0%,P0.01)。体细胞核移植通过影响Dnmt和Tet家族基因的表达引起IGF2-H19基因座甲基化的异常,导致基因印记紊乱,进而影响再克隆的效率。     

牛Wif1基因印记及甲基化调控印记的分子机制研究

为了研究Wif1基因在牛中的印记状态和调控印记的分子机制,本研究首先应用基于单核苷酸多态(SNP)的测序方法,分析了Wif1基因在牛组织中的印记状态,结果发现,Wif1基因在牛中的印记表现出组织特异性,在肺中为单等位基因表达,而在心、肝、脾、肾、肌肉和脂肪6个组织中为双等位基因表达。进一步应用亚硫酸氢盐测序法分析Wif1基因启动子区29个CpG位点在牛肺(单等位基因表达)和肝(双等位基因表达)组织中等位基因特异的甲基化状态,结果发现,在肺和肝中,两条亲本链间的甲基化水平无显著差异(P0.05)。进一步分析每个CpG位点在肺和肝中亲本链间甲基化率差异,发现与双等位基因表达的肝相比,肺中存在8个亲本链间甲基化率差异显著的CpG位点,其中3个(第1、2和6)位于转录因子的结合位点上。由于单个CpG位点的甲基化变化会影响转录因子的结合,推测这3个CpG位点的甲基化可能参与调控Wif1基因的组织特异性印记。     

DNA甲基化调控牛AQP1基因的胎盘特异性印记

为揭示牛AQP1（aquaporin 1）基因在不同组织及胎盘中的印记状态，以及DNA甲基化修饰在印记中的调控机制，本研究采用基于SNP的PCR产物直接测序的方法，对32头健康雌性成年荷斯坦奶牛心组织及15个自然分娩后的胎盘试验样本进行检测，确定了5头杂合子个体牛和3个杂合子胎盘，对其组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪）和胎盘进行AQP1等位基因表达分析及印记状态分析，利用亚硫酸氢盐测序法分析AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛在牛心、肝组织、2个胎盘和对应精子中的DNA甲基化状态。结果发现，在杂合子牛被检测的7个组织中，AQP1基因呈现双等位基因表达；而在胎盘中，AQP1基因为单等位基因表达。通过分析杂合子胎盘对应的亲本基因型，发现AQP1基因为母源等位基因表达，即父源印记。进一步比较分析AQP1基因启动子区CpG岛在牛组织、胎盘及对应精子中的甲基化状态，在双等位基因表达的心脏、肝脏组织中，该区域未发现差异甲基化区（differentially methylated regions，DMR）；而在单等位基因表达的胎盘中，存在差异甲基化区，同时父源等位基因精子中为重甲基化状态。以上结果说明，牛AQP1基因为胎盘特异性单等位基因表达的父源印记基因，且AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛甲基化修饰参与调控牛胎盘的印记表达；在被检测的组织中为双等位基因表达。     

NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中DNA甲基化与基因表达分析

为了解黑麦草（Lolium perenne）种子在正常条件与NaCl胁迫下萌发过程中DNA甲基化动态变化以及重要盐胁迫相关基因的表达。运用甲基化敏感扩增多态性技术分析对照和150 mmol·L^-1 NaCl处理下黑麦草种子萌发过程（0,1,2,4,7 d）的DNA甲基化水平及动态变化,并通过实时荧光定量 PCR（QRT-PCR）检测8个重要的盐胁迫相关基因的表达情况。结果表明：黑麦草种子萌发过程中甲基化水平呈下降趋势,以双链甲基化方式为主,甲基化变化同时发生在编码序列和非编码序列中。NaCl处理下DNA甲基化程度高于CK,而去甲基化程度低于CK,最终导致NaCl处理下基因组净的甲基化位点数目增加。黑麦草种子耐盐萌发过程中代谢增强,8个盐胁迫相关基因表达量呈上升趋势,而NaCl胁迫延缓了种子萌发进程,在大多数时间点的基因表达低于对照。