冷诱导基因转录因子CBF1的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响

通过农杆菌介导法将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因以及CaMV35启动子调控的GUS基因一起转化烟草,研究了冷诱导基因的转录因子CBF1(CRT/DRE binding factor 1)对植物抗寒性及生长发育的影响。结果表明:CBF1的组成型表达增强了冷敏感植物的抗寒性;在表型上使植株矮壮,叶片着生密集,叶色深绿,叶厚度增加;促进侧枝生长,延长营养生长期,推迟花期;对植株的结实性无明显影响。植株抗寒能力以及表型变化程度与CBF1的表达强度相关。因此,利用CBF1基因进行植物遗传改良时应根据物种的应用特点采用合适的表达调控策略。     

构建脱水反应元件（DRE）报告子以用于小叶杨DRE转录因子的克隆

许多诱导型基因的表达均受特定的转录因子和顺式元件调控，脱水反应元件（Dehydration-Responsive Element，DRE）对植物的抗旱和抗低温基因的表达调控具有重要作用。拟南芥等草本植物的特异性结合DRE转录因子已有所研究，但木本植物中能够特异性识别DRE的转录因子尚未见报道。酵母单杂交技术是发现序列特异性DRE结合转录因子的一种很有效的方法。而获得含有DRE顺式元件的报告酵母菌株是应用酵母单杂交技术研究树木来源的DRE结合转录因子的前提。本文通过基因合成构建含有DRE顺式元件的报告酵母菌株，初步研究表明该报告酵母菌株可以用于研究与寻找木本植物DRE结合转录因子，为通过基因工程手段改善树木抗逆性研究奠定了科学基础。     

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性。本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析。结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991bp,包括624bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114bp的5’UTR和253bp的3’UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)11。生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族。沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础。     

高羊茅DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

DREB转录因子是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的反式作用因子。为了分离和鉴定高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)DREB转录因子基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,用拟南芥DREB1A基因作探针筛选该文库得到一个DREB类基因FaDREB1。序列分析表明,FaDREB1具有一个651bp的开放阅读框和229bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域。酵母单杂交结果表明FaDREB1蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能。Northern杂交结果发现FaDREB1基因受低温的诱导表达,对高盐、干旱和ABA没有反应,说明FaDREB1基因在高羊茅植株对低温的应答反应中起重要作用。     

植物抗逆反应中的转录因子网络研究进展

植物生长发育过程中会经历各种生物及非生物胁迫,转录因子所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种胁迫反应中起着重要的作用.目前已鉴定的与植物抗胁迫有关的转录因子及家族主要有碱性域亮氨酸拉链(basic-domain leucine-zipper,bZIP)、禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)、乙烯应答元件组合蛋白/因子(APELATA2/ethylene-responsive element binding proteins/factors,AP2/EREBP)、WRKY和NAC等.这些转录因子与特定的顺式作用元件结合组成调控网络,特异地调控植物胁迫反应中各种相关抗性功能基因的表达,提高植物对环境胁迫的适应能力.     

转CBFI基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

CBF1(C-repeat-binding factor1)基因来源于拟南芥的一个受低温调节的转录因子基因,能激活一系列其它低温相关基因的表达,从而提高植物的抗冻能力(Jaglo-Ottosen et al.,1998)。在研究中发现转CBF1基因烟草后代的部分群体中出现了明显的表型变异,主要表现为花器官的变异。为了探明这些变异是否是因为外源基因在受体基因组中插入的位点不同而造成,本实验从转CBF1基因烟草的后代中筛选了2个花器官差异较大的植株。用TAIL-PCR方法从该2株转基因烟草中分别扩增出了T-DNA插入位点的侧翼序列。     

茶树抗寒基因CsCBF1与CsICE1低温下的表达分析

为探明茶树抗寒转录因子基因CsCBF1与CsICE1的表达特性,以茶树幼苗为试验材料,根据其他已知植物的抗寒转录因子基因CBF1与ICE1序列,通过同源克隆法获得茶树中相对应的同源基因CsCBF1与CsICE1的保守区域,长度分别为456 bp与643 bp,经比对确定为CBF与ICE转录因子家族基因中CsCBF1与CsICE1型基因,因此命名为CsCBF1与CsICE1。荧光定量PCR分析CsCBF1与CsICE1基因在冷胁迫条件下的表达情况,发现其在4℃处理8 h时表达量最高;在茶树叶片中表达量显著高于根、茎、花。低温下CsCBF1与CsICE1基因表达显著增加,并且在抗寒性较强的种质(0306I和黄旦)中的表达显著高于抗寒性相对较弱的种质(0306F和0306D)。本研究结果为进一步探究CsCBF1与CsICE1基因在茶树耐低温胁迫过程中基因表达的调控机制奠定了基础。     

转录因子在植物进化和抗逆中的作用

植物基因的表达调控是一个复杂且精准的网络系统,一般包括转录水平和翻译水平二个层次。转录水平的调控发生在基因表达的初期,是许多基因表达调控的主要方式。在此调控过程中,被称为转录因子的蛋白质特异结合到靶基因的顺式作用元件上,控制着一系列相关基因的表达,在植物生长发育、物种起源和逆境胁迫应答过程中起着非常重要的作用,是生物遗传多样性的重要遗传基础。由于转录因子的重要作用,人们对其作用机理的理解也日渐深入。根据近期的研究进展,本文就转录因子在植物驯化、生物和非生物逆境胁迫方面的工作进行概括梳理,希望读者对此领域有一个比较深入和系统的认识,同时也能为挖掘具有关键功能的转录因子,提高重要农作物的遗传改良效率提供借鉴。     

植物转录因子功能分析方法

植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。通过各种途径已经分离出大量经序列分析推断为转录因子的基因，但由于方法的局限性，其功能特征还研究得很不够。综述概述了当前常用的研究植物转录因子功能的分子生物学方法，同时介绍了一些研究植物转录因子功能的新方法，如双链RNA和基于糖皮质激素受体的基因诱导表达。     

玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。     

小麦Wcor719基因的原核表达及转化烟草和棉花提高抗冷性研究

为研究Wcor719基因的抗寒功能,获得具有抗寒性的棉花新种质,构建小麦冷诱导基因原核表达载体Wcor719-pET28a进行蛋白表达,SDS-PAGE分析表明其诱导蛋白大小约为24.0kD,表达量在诱导4h时达到最大,且与IPTG诱导浓度无明显相关性。同时通过农杆菌介导的叶盘法将构建的Wcor719-pCambia1301植物表达载体转入烟草(Nicotiana tabacum)SR-1中,T1代转基因烟草植株经过抗生素筛选和PCR检测后进行低温胁迫,测定抗寒生理指标,结果显示转基因植株的脯氨酸和可溶性糖含量均比对照有所提高。该基因经过功能验证后用花粉管通道法转入棉花(Gossypium hirsutum)新陆中49,T0代、T1代经过田间检测及PCR检测后研究T2代转基因棉花低温胁迫下的抗寒性,结果显示,转基因棉花脯氨酸含量和可溶性糖含量均在第5天达到峰值,且明显高于对照;而丙二醛含量低于对照,初步证明转基因烟草和棉花的抗寒性均有所提高,由此表明通过转冷调节基因来提高植物的抗寒性具有良好的应用前景。     

Dehydrin from citrus, which confers in vitro dehydration and freezing protection activity, is constitutive and highly expressed in the flavedo of fruit but responsive to cold and water stress in leaves

A cDNA encoding a dehydrin was isolated from the flavedo of the chilling-sensitive Fortune mandarin fruit (Citrus clementina Hort. Ex Tanaka x Citrus reticulata Blanco) and designed as Crcor15. The predicted CrCOR15 protein is a K2S member of a closely related dehydrin family from Citrus, since it contains two tandem repeats of the unusual Citrus K-segment and one S-segment (serine cluster) at an unusual C-terminal position. Crcor15 mRNA is consistently and highly expressed in the flavedo during fruit development and maturation. The relative abundance of Crcor15 mRNA in the flavedo was estimated to be higher than 1% of total RNA. The high mRNA level remained unchanged during fruit storage at chilling (2 degrees C) and nonchilling (12 degrees C) temperatures, and it was depressed by a conditioning treatment (3 days at 37 degrees C) that induced chilling tolerance. Therefore, the expression of Crcor15 appears not to be related to the acquisition of chilling tolerance in mandarin fruits. However, Crcor15, which was barely detected in unstressed mandarin leaves, was rapidly induced in response to both low temperature and water stress. COR15 protein was expressed in Escherichia coli, and the purified protein conferred in vitro protection against freezing and dehydration inactivation. The potential role of Citrus COR15 is discussed.     

磷脂酶Dβ在拟南芥低温信号中的转导作用

磷脂酶D（PLD）不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶,而且是一类重要的跨膜信号转导酶类。PLD的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植物的抗冻性。本研究以PLDβ基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型植株为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,并分析其作用途径。结果表明,PLDβ基因介导低温信号转导作用,参与渗透调节途径中脯氨酸的调控和抗氧化系统中过氧化氢酶（CAT）活性的调控,并且与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。本研究为探索通过调控PLD的活性提高植物抗冻性提供了新的途径,并为深入揭示植物的抗冻机理以及磷脂信号转导机制提供实验支持。     

Coronatine‐induced lateral‐root formation in cotton (Gossypium hirsutum) seedlings under potassium‐sufficient and ‐deficient conditions in relation to auxin

A large root system plays a decisive role in potassium (K)‐acquisition efficiency of cotton. Coronatine (COR), a non‐host‐specific phytotoxin, may affect the auxin level in plants and might therefore be useful in regulating lateral‐root (LR) development. Our objectives were (1) to examine the effects of COR on root development, especially the LR formation in hydroponically grown cotton seedlings, and (2) to explore possible mechanisms involved. The results showed that K deficiency (0.05 mM) significantly reduced LR formation in cotton seedlings, possibly due to the decrease of endogenous indole acetic acid (IAA) in roots by more than half. Following the application of 10 nM COR, the LRs significantly increased by 26% in K‐sufficient (0.5 mM) solution and by 95% in K‐deficient solution. Although COR did not increase the free IAA level in the primary root, the polar auxin‐transport inhibitor N‐1‐naphthylphthalamic acid (NPA) decreased its stimulating effects on LR formation by 25%–30%, suggesting that the COR‐induced LR formation was independent of increased auxin level but likely associated with auxin transport. Treatment of plants with 1‐naphthalene acetic acid (NAA) increased LR formation at NAA concentrations of 100 nM, but had no effect at 10 nM. In the presence of 1 nM COR, however, NAA increased LR formation at 10 nM concentrations. This indicates that LR formation due to COR possibly involves changes in auxin sensitivity. In addition, the shorter LRs of COR‐treated seedlings were clearly restored when COR was removed from solutions for 12 d, and the total root length, total root surface area as well as K uptake increased significantly, suggesting that COR may be potentially useful for enhancing the K‐acquisition efficiency of cotton seedlings.     

观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建立

观赏羽衣甘蓝是一种赏食兼用的耐冻优良景观植物。为了通过基因工程手段赋予其抗虫性,并进一步提高其低温耐受性,获得新的抗性种质,本研究以优良育种品系为试材,详细探讨了影响离体培养不定芽再生的因素,建立了高效再生体系。以8份不同类型羽衣甘蓝基因型的带柄子叶、子叶、下胚轴为外植体,研究了不同基因型、不同外植体、不同的培养基激素浓度配比及添加AgNO3对不定芽诱导的影响。结果表明:无论基因型及使用的培养基,带柄子叶均为最佳外植体;不同的基因型、不同外植体其最佳的芽诱导培养基不同;筛选出两份材料,其带柄子叶分别在L6(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L)及L3(MS+6-BA1.5mg/L)培养基中不定芽诱导率为100%,下胚轴诱导率最高也能达88.33%;培养基中添加4mg/L AgNO3不利于羽衣甘蓝的不定芽诱导;再生株生根以MS+NAA0.1mg/L效果好,生根率可达100%。     

采用高速摄影技术测定油葵籽粒三维碰撞恢复系数

为了建立油葵籽粒在收获、输送等机械化生产环节中与机具零部件间作用的碰撞模型。该文基于镜面反射原理和运动学原理,设计了模拟三维空间坐标系的油葵籽粒碰撞恢复系数测定装置。选取新疆收获期矮大头DW667品种油葵籽粒作为研究对象,借助高速摄影技术,记录油葵籽粒在空间碰撞运动中的三维动态坐标。针对影响油葵恢复系数的因素:碰撞材料、下落高度、碰撞角度、碰撞部位、材料厚度和含水率等开展了单因素试验和正交试验研究。单因素试验结果表明,油葵籽粒与Q235、铝合金、有机玻璃、橡胶等碰撞材料之间恢复系数依次减小;油葵籽粒与Q235之间恢复系数,随碰撞角度的整体变化趋势是随碰撞角度增加而增大,随着下落高度的增加而减小,随着材料厚度的增加而增大,随着含水率增大而降低,且在碰撞部位试验中,籽粒上侧与碰撞材料碰撞恢复系数最大。建立了下落高度、碰撞角度、材料厚度、含水率与恢复系数的回归方程,且方程的决定系数均大于0.95。正交试验结果表明,影响恢复系数各因素的次序为:碰撞材料>碰撞部位>下落高度>碰撞角度>材料厚度>含水率,其中碰撞材料、下落高度、碰撞角度、碰撞部位影响极显著,材料厚度、含水率影响显著。对比试验结果表明:基于古典牛顿法求解的恢复系数值小于能量角度求解的恢复系数值;三维碰撞法比二维碰撞法求解的恢复系数值高。验证试验结果表明:三维碰撞法计算出的预测反弹高度值更接近油葵籽粒实际反弹高度值。该研究结果可为油葵机械化生产关键部件优化设计提供参考以及为农业物料参数求解提供新的思路。     

小麦胁迫响应转录因子基因TaSNAC1的克隆与表达分析

胁迫响应NAC转录因子参与植物非生物胁迫过程,过表达水稻(Oryza sativa)SNAC1可显著提高植株耐旱、耐冷和抗盐性。本研究同源克隆了小麦(Tricum aestivum)TaSNAC1基因(GenBank登录号No.JN621240),分析了其表达产物的亚细胞定位,并利用实时定量RT-PCR分析了其在不同组织、PEG和NaCl胁迫下的表达。该基因包含一个内含子,编码329个氨基酸残基的蛋白产物。TaSNAC1与其他禾本科植物SNAC1蛋白高度相似,其与大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻、玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)SNAC1序列相似性依次为97.3%、86.3%、81.1%、79.1%和79.2%。TaSNAC1可能以二聚体形式存在,包含核定位信号和典型的NAM结构域,100~107位的"WKATGXDK100-107"核心基序处于一段β折叠中,其弯曲产生的凹面可能直接参与DNA结合。瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶肉细胞原生质体的实验表明,TaSNAC1特异定位于细胞核中。盐胁迫条件下,叶和根中TaSNAC1的表达量均升高,且表达模式相似,但根中响应更显著;PEG胁迫下,根中TaSNAC1对胁迫的响应较快且幅度较大,而叶中响应较慢且幅度较小。研究结果提示,TaSNAC1参与小麦的非生物胁迫响应过程,在耐旱、抗盐遗传改良中具有潜在应用价值。     

Adaptations to overwintering in the earthworm Dendrobaena octaedra: Genetic differences in glucose mobilisation and freeze tolerance

Geographic variation in freeze tolerance, glycogen storage and freeze-induced glucose mobilisation was investigated in the earthworm Dendrobaena octaedra. Specimens from 15 populations collected in Canada, Greenland and Europe were reared in the laboratory in a common-garden experiment to test whether glucose and glycogen concentrations correlated with genetic variation in freeze tolerance among the populations. Populations from Canada, Sweden, Poland and Finland did not differ much in their freeze tolerance and were able to tolerate freezing for 18 d down to at least −14 °C (lowest temperature tested). Specimens collected in a relatively warm climate (Denmark) were the least freeze tolerant, and also had the lowest concentrations of glucose when frozen at −2 °C. However, there was no clear evidence that glucose concentration is a determinant in the degree of freeze tolerance of D. octaedra when considering the whole assemblage of populations. The role of phylogenetic inertia was tested by looking for serial independence and no influence of phylogeny was detected in our findings allowing us to exclude the possibility that phylogenetic relatedness between populations is a major evolutionary factor explaining the observed differences for freeze tolerance and related traits. The size of the glycogen reserve was significantly correlated with the ability to tolerate freezing. Large glycogen reserves may be advantageous in very cold regions in order to maximise cryoprotectant production and/or as a source of energy for the anaerobic metabolism occurring during prolonged freezing.     

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶仅基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性。结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程。对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程。