猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高(99.5%~100%),而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

本研究运用同源重组的方法,在伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株PRV JS-2012基础上,构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒,命名为r PRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析,结果表明重组病毒构建成功,并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示,r PRV JS-2012-EGFP与亲本株PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将r PRV JS-2012-EGFP毒接种14日龄PRV阴性仔猪,能使实验猪100%发病,病死率高达40%,表明r PRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株,在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。     

伪狂犬病毒SN株、SL株的分离鉴定

对琼扩试验检测为伪狂犬病毒 (PRV )阳性的病料 ,采用MDBK细胞进行病毒分离培养 ,获得了两株PRV ,进而经家兔接种和核酸杂交鉴定为PRV阳性 ,将其分别命名为PRVSN株、SL株。     

伪狂犬病毒感染ST细胞的增殖抑制及对细胞周期的影响

以猪伪狂犬病毒(PRV)容A株感染体外培养的ST细胞为模型,采用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞计数检测梯度剂量的PRV病毒感染ST细胞株过程中细胞的增殖抑制及对细胞周期的影响.结果显示,PRV感染前期(8h和16h)促进ST细胞的增殖,24h以后可显著抑制细胞增殖,这种抑制与时间密切相关,与感染剂量无显著相关.PRV感染ST细胞可显著地改变细胞周期各时相分布,24 h时细胞G1、S期所占比例明显升高,48 h细胞停滞在G2期,出现明显的凋亡峰.结果表明,PRV在感染过程中对细胞生长的影响与时间紧密联系,最终可显著使细胞停滞在G2期,诱发细胞调亡.     

羊伪狂犬病毒的分离鉴定

山东省某羊场猪羊混养,羊发生了一种以口吐白沫、有神经症状、腿部部分掉毛为特征的疾病,死亡率高达100%。为确定病原,对病死羊进行病原分离、PCR检测、直接免疫荧光鉴定,确诊病原为伪狂犬病毒(PRV)。通过测序发现,分离毒株的g E基因与NCBI上公布的已知PRV基因组核苷酸序列同源性在97%~99%之间,说明分离株为伪狂犬强毒。该病毒通过BHK细胞系传代至第7代时出现了明显的细胞病变,按照Reed-Muench法计算病毒半数组织细胞感染量(TCID50)为1×107.5/m L。用分离株毒液注射体重20 kg健康绵羊2只,4 d后羊只出现伪狂犬病(PR)的典型症状。根据临床症状及PCR诊断结果,通过采取淘汰场内猪群并对猪舍加强消毒、病羊注射伪狂犬血清、假定健康羊群投喂抗病毒中药七清败毒颗粒等综合防控措施,羊场疫情得到了有效控制。     

肉桂酸衍生物抗PRV及其作用机制研究

以猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞,对27种天然化合物的抗PRV作用进行筛查,并探讨抗PRV活性物质的作用机制。分别将27种天然化合物以不同方式作用于感染细胞,采用细胞病变法(CPE)和噻唑蓝比色法(MTT)测定其细胞毒性及对病毒吸附、复制和直接杀灭的作用。在药物与PRV共同作用于PK-15细胞24、48、72 h后,RT-PCR检测PRV的代表基因IE180、UL30和UL22在胞内的表达量。结果显示,肉桂酸衍生物(cinnamic acid derivative,CAD)具有抗PRV的活性,其EC50为(8.443±0.216)μg/m L,SI为6.6,最高抑制率为76%。3个时间点胞内IE180、UL30和UL22基因的拷贝数显著降低(P0.01),且呈剂量依赖性。结果表明,CAD对PRV有直接灭活作用,其作用机制是阻断PRV在细胞内的生物合成过程,但CAD对PRV的吸附过程没有阻断作用。CAD可作为抗PRV的候选药物。     

猪伪狂犬病毒CC株的分离与鉴定

从吉林省长春市某猪场送检的一头发热、流涎、肌肉痉挛、角弓反张的9日龄仔猪中分离到一株病毒。该病毒能在猪肾细胞(PK-15),仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖并产生典型的细胞病变(CPE),从流行病学,临床症状和病理变化均与伪狂犬病相似,该病毒能被伪狂犬病毒阳性血清中和,电镜观察可见椭圆形、直径为110-180nm典型疤疹病毒粒子,用该病毒接种家免和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。经鉴定,证明此病毒确为伪狂犬病病毒(PRV),并将该病毒命名为PRVCC株。     

猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研...     

编码基因完整的伪狂犬病毒细菌人工染色体的构建

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶AcclⅠ处理过的病毒全基因组连同转移载体共同转染BHK21细胞,获得重组病毒;利用PCR检测、电镜观察及生长曲线测定对野毒与重组毒的基本特性进行了比较。结果表明:重组病毒可以稳定地表达绿色荧光,BAC在传代过程中能够稳定存在;重组病毒在电镜下的形态与野毒未见差异,其生长曲线也基本同野毒吻合。说明成功构建的编码基因完整的PRV细菌人工染色体可用于该病毒的结构生物学及致病机理研究。     

无血清悬浮培养BHK21细胞增殖伪狂犬病毒的参数研究

旨在筛选适合生物反应器悬浮培养BHK21细胞的无血清培养基,并利用该技术培养伪狂犬病毒。通过筛选市售的无血清培养基,以细胞形态、细胞活率和增殖倍数作为驯化指标,对BHK21细胞进行无血清驯化;对使用10 L和40 L生物反应器无血清悬浮培养BHK21细胞的参数进行研究;同时利用筛选的无血清培养基和悬浮细胞进行伪狂犬病毒增殖测试。结果表明,市售培养基Ⅰ符合筛选要求,其培养的细胞形态比较均一,结团少,细胞生长2 d的增殖倍数为3.5倍,细胞活率在95%以上;生物反应器悬浮培养BHK21细胞的最适参数为转速80 r/min、pH值7.2、DO 60%;利用该工艺技术培养伪狂犬病毒,当接种细胞密度为6×10⁶ cells/mL,接毒剂量为0.3%时,48 h收获的病毒液滴度可达10^9.5 TCID₅₀/mL。该试验实现了伪狂犬病毒的无血清悬浮生产,为其生产工艺的优化提供了可能。     

猪伪狂犬病病毒HDDJ株的分离鉴定

广东省某猪场常规免疫猪伪狂犬病疫苗(Bartha-K61株)的母猪流产,疑似为猪伪狂犬病病毒感染。为确定发病原因,将流产胎儿的脑、淋巴结、肺脏研磨混合液接种Vero细胞,形成稳定细胞病变(CPE),并测定其细胞半数感染量(TCID50),通过PCR鉴定、测序比对、进化树分析,确定感染病毒及基因型,动物回归实验判定病毒致病性。结果表明,分离毒株为PRV中国变异株,命名为HDDJ株,与猪伪狂犬病疫苗Bartha-K61株亲缘关系较远。     

基于iTRAQ技术伪狂犬病毒感染宿主细胞差异表达蛋白质组分析

为了研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞后宿主蛋白的差异表达情况,寻找PRV与细胞相互作用的重要分子,本试验将PRV接种PK-15细胞,运用同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合色谱/串联质谱联用技术,开展病毒感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过qPCR对其数据进行验证。以未接毒细胞为对照,通过数据库检索,分析出3 062个蛋白,共鉴定到27个差异表达蛋白,其中21个蛋白下调,6个蛋白上调。这些差异蛋白主要参与代谢过程、生物调控、应激反应以及定位等生物学过程,具有结合活性、催化活性、转录活性等分子功能。NFκB1、PIK3R2、HSPA1L等差异蛋白在多条通路中发挥作用。POP1、UTP15和ND4的表达变化情况与iTRAQ结果变化趋势一致,证明了该数据的可靠性。本试验研究结果为进一步研究PRV致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。     

伪狂犬病毒的microRNAs靶基因预测及功能鉴定

为研究猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)编码的微小RNA(micro RNA,mi RNA)的功能,本研究通过生物信息学预测结合双荧光素酶报告系统验证方法,对病毒mi RNA(virus mi RNA,vmi RNA)进行靶基因鉴定。结果表明,PRV编码的prv-mi R-LLT1、prv-mi R-LLT7和prv-mi R-LLT9对病毒转录极早期基因IE180有抑制作用,prv-mi R-LLT7对参与调控病毒复制的UL48基因有抑制作用。初步研究表明这些vmi RNA可能在病毒感染过程中具有基因调控作用,本研究结果为进一步研究PRV vmi RNA在病毒复制、免疫逃避及潜伏感染过程中的功能奠定了基础。     

过硫酸氢钾复合盐消毒剂、温度和紫外线对伪狂犬病毒灭活效果研究

为探索过硫酸氢钾复合盐消毒剂、温度、紫外线对伪狂犬病毒(PRV)的杀灭效果,采用3种不同厂家生产的过硫酸氢钾复合盐消毒剂(稀释100～800倍)、5个温度(70、75、82、90、100℃)及2个紫外线(照射距离为1、1.5 m)处理PRV,观察已处理的病毒感染Vero细胞后细胞病变(CPE)产生的情况;PCR检测病毒核酸的增殖情况。结果显示:BIOX卫可消毒液稀释100～800倍对Vero细胞无显著毒性作用;杜邦卫可、迈微卫可消毒液在稀释100倍时有显著的毒性作用,稀释200～800倍范围内不影响细胞生长;消毒液抗PRV试验显示,3种不同厂家的卫可消毒剂对PRV具有抑制或杀灭作用,以1∶200终浓度进行消毒30 min以上效果最好;高温对病毒具有显著的杀灭作用,用70℃处理病毒3 min即可杀灭病毒;在照射距离为1 m范围内用紫外线照射病毒60 min以上,可完全杀灭病毒。结果表明:过硫酸氢钾复合盐、高温处理、紫外线照射处理均对PRV具有抑制或杀灭作用;增加消毒剂的有效剂量、上调温度及延长消毒有效时间,能够保证消毒工作达到标准水平,进而从根源上切断病原传播的各种途径。试验结果对其他病毒性疾病的防控工作中消毒剂的选择具有重要的参考价值。     

生物表面活性素体外抗病毒活性

测定了表面活性素(Surfactin)的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作用,并对其可能的机理进行了初步的探讨.结果表明,生物表面活性素对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)的TD50和TD0分别为62.5、16.125 mg/L;对猪肾(Porcine kidney,PK-15)细胞的TD50和TD0分别为31.25、4.03 mg/L;对NDV LaSota株、PRV株所致细胞病变效应有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;表面活性素可以直接作用于NDV LaSota株、PRV株,具有一定的抗病毒作用;同时还具有一定的预防NDV LaSota株感染及抑制其复制的作用.但对PRV病毒作用不显著.其抗病毒效果和相应的阳性对照抗病毒药物病毒唑(Ribavirin),无环鸟苷(Acyclovir,ACV)相当,并且由于其细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行开发研究.     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

关于伪狂犬病,你知道多少?

正伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种动物传染病,多种动物都可感染PRV,其中猪最敏感,发病也最严重。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病,其危害性可见一斑。近年来,猪伪狂犬病暴发来势汹汹,但养殖户对伪狂犬病缺乏认识和重视,造成严重的经济损失,本文就伪狂犬病病原及其危害作简要介绍。伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种动物传染病,多种动物都可感染PRV,其     

南京及周边地区猪伪狂犬病病毒野毒感染的抗体调查

应用美国IDEXX生产的伪狂犬病毒gE诊断试剂盒,检测了南京市及安徽省滁州市、马鞍山市、芜湖市在2018年~2019年间送检的683份血清样品,并对不同地区、不同年龄阶段的猪血清学结果数据进行统计学分析。结果显示,在这次调查中,各地均存在猪伪狂犬病毒(PRV)感染,场阳性率为82.35%(28/34),样品阳性率为40.26%(275/683),不同日龄感染PRV的阳性率也不同,高低依次为生产母猪>育肥猪>保育猪>哺乳仔猪。     

伪狂犬病毒对鼠脾细胞分裂抑制性研究

伪狂犬病毒(PRV)的感染可使猪产生免疫抑制，从而导致其它病毒和细菌的继发感染。这种免疫机制抑制机理尚不清楚，本研究以小鼠为试验对象，探索了PRV对免疫系统的影响。用BALB／C小鼠的脾脏制备脾细胞和淋巴细胞进行体外培养，并检测细胞的增殖能力。表明PRV在淋巴细胞中并不繁殖，但感染细胞的分裂能力却受到了抑制。经紫外线灭活后的PRV同样能抑制鼠脾细胞的增殖。结果表明，可能是由于PRV的结构成分导致免疫抑制。