水稻、菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)重组蛋白表达及酶活性分析

本研究目的是通过基因克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得水稻(Oryza sativa subs.japonica)、菠菜(Spinacia oleracea)甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH和SpBADH)的融合蛋白,体外测定两者的醛脱氢酶活性,说明水稻存在OsBADH且具有醛脱氢酶功能。通过RT-PCR成功克隆了OsBADH和SpBADH基因的全长序列,二者氨基酸序列同源性为70.8%。OsBADH和SpBADH的重组质粒均可在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE分析表明,经0.4mmol/LIPTG诱导的融合蛋白条带约70kD。两者的表达产物经TALON金属螯合树脂纯化后进行酶活测定,结果显示都具有甜菜碱醛脱氢酶活性。OsBADH的比活力为74.87nmol/min/mg,对照SpBADH比活力为86.84nmol/min/mg,表明OsBADH能够有效行使醛脱氢酶功能,而高效液相色谱法未在水稻叶片中检测出甜菜碱。研究结果提示,水稻可能并非由于BADH自身不具有酶活而不积累甘氨酸甜菜碱,该研究为进一步探讨水稻中甜菜碱合成的分子机制提供了研究基础。     

利用转录组测序技术鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答基因

盐害是影响紫花苜蓿生产力的主要非生物因素之一,鉴定控制这一复杂性状的基因将为苜蓿育种计划提供关键信息。为揭示紫花苜蓿在盐胁迫下基因表达谱的变化,以紫花苜蓿Millennium为材料,对正常培养(WT_CK1)和盐胁迫(WT_N1)条件下的2个样品根系进行转录组分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分关键基因的表达特点进行验证。结果表明,紫花苜蓿根系在250 m M Na Cl胁迫72 h时,共检测到31 907个基因表达量发生了改变,2 758个基因的表达量差异达到2倍以上,包括199个转录因子,其中1 338个表达量上调,1 420个表达量下调,这些差异表达基因功能主要涉及次生代谢、代谢途径、激素代谢及信号转导和植物病原菌互作等。qRT-PCR分析表明,6个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。综上,紫花苜蓿根系对盐胁迫响应是一个多基因参与、多个生物代谢过程反应协同调控的过程,基因表达量的变化可能是调控的主要方式。此外,本研究候选了一系列胆汁酸:Na+共转运蛋白、晚期胚胎发生富集蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶基因和转录因子等与紫花苜蓿盐胁迫相关的应答关键基因,为揭示紫花苜蓿耐盐分子机制奠定了基础。     

印度梨形孢通过促进渗透调节物质的合成和诱导抗逆相关基因的表达提高烟草耐盐性

内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)已被证明能够增强许多植物对生物和非生物胁迫的抗性。为了研究印度梨形孢对烟草(Nicotiana tobacum)耐盐性的影响,本研究用300 mmol/L NaCl溶液处理接种和未接种印度梨形孢的烟草,分析两者在受盐胁迫后丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、相对电导率大小以及与耐盐胁迫相关基因表达水平的差异。结果表明,盐处理后,烟草叶片中MDA含量和相对电导率在接有印度梨形孢的烟草中显著低于未接种的烟草(P0.05);而接种印度梨形孢的烟草Pro含量显著高于未接印度梨形孢的烟草植株(P0.05)。RT-PCR分析表明,盐胁迫下根部接有印度梨形孢和未接印度梨形孢的烟草叶片中盐胁迫相关基因OPBP1、病程相关(PR)蛋白基因PR-1a、PR2、PR3和PR5都上调表达,这些基因在接种印度梨形孢的烟草中的表达量显著高于未接种的烟草(P0.05),表明盐胁迫下,印度梨形孢诱导烟草中抗盐相关基因的大量表达。结果表明:印度梨形孢提高烟草对盐胁迫的抗性,与MDA含量、质膜透性、Pro含量和相关基因的表达相关。接种印度梨形孢的烟草在盐胁迫下能维持生物膜系统的完整性和细胞内渗透压的稳定性以及膜脂过氧化较低水平,对盐胁迫的抗性增强。本研究初步明确了印度梨形孢提高烟草耐盐性的作用与部分机理,为深入研究印度梨形孢提高烟草的抗逆性作用及其机理提供基础资料。     

花生GLP家族基因组织差异及干旱诱导的表达分析

为深入探索花生GLP家族基因的功能,利用实时荧光定量PCR技术比较不同花生品种种皮和干旱胁迫下花生不同组织中花生GLP家族基因的表达情况。结果表明,花生GLP家族基因在粉红色花生品种种皮中的表达量显著高于其它颜色种皮;在花生种皮中,Ah GLP3和Ah GLP6的表达量相对最高,其次是Ah GLP1、Ah GLP2和Ah GLP8。正常生长条件下,除Ah GLP2和Ah GLP8,其它各基因在种子、根和叶中的表达均有明显的组织差异。在干旱胁迫下,Ah GLP1在叶片中的表达量发生上调,而Ah GLP3、Ah GLP4和Ah GLP5在种子和根中的表达量显著上调;Ah GLP2、Ah GLP7和Ah GLP8在各组织中均受干旱诱导而表达量上调,而Ah GLP6的表达量下降。结果表明花生GLP家族基因的表达有明显的品种特异性、组织和诱导差异性。本研究为阐明花生GLP家族基因的组织及抗逆表达提供理论基础。     

植物盐诱导基因的研究进展

阐述了的几年有关植物盐诱导基因的研究进展,主要淑及与以下几个方面有关的分子克隆或基因：（１）渗透调节,包括对脯氨酸、甜菜碱、糖醇代谢的调节;（２）光合作用与代谢;（３）钙调蛋白;（４）通道蛋白;（５）胚相关蛋白等,并对本研究领域的发展趋势进行了讨论。     

过量表达盐芥TsIPK2基因增强转基因水稻耐盐性

【目的】本试验以野生型(WT)和转盐芥TsIPK2基因的水稻为材料,研究NaCl胁迫条件下过量表达TsIPK2基因对水稻植株抗盐胁迫能力的影响。【方法】取水稻材料种子和其3叶龄幼苗,分别在不同NaCl浓度(0、50、100、150、200 mmol/L)下进行处理。检测WT与过量表达TsIPK2基因水稻种子的发芽率、主根长和芽长、幼苗的丙二醛(MDA)和脯氨酸的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及与胁迫相关的5个基因的表达。【结果】在盐胁迫下,与野生型相比,转基因水稻具有更好的发芽率、主根长和芽长。野生型和转基因水稻两者的脯氨酸含量增加,转基因水稻的积累量显著高于野生型,但是转基因水稻MDA含量增加幅度小于野生型。野生型和转基因水稻幼苗SOD酶活性均增加,但转基因植株的酶活性显著高于野生型;二者POD酶活性呈现先升高后下降的趋势,但是二者活性没有显著的差别;转基因水稻的CAT活性也呈现先升高后下降的趋势,然而野生型水稻的CAT活性在盐胁迫下没有显著的变化。高盐处理后,野生型和转基因水稻的5个与胁迫相关的基因表达倍数都增加,与野生型相比,转基因水稻的OsP5CS1、OsSOD、OsCATB和OsLEA3的表达量显著升高,而OsPOX1基因的表达量变化不显著。【结论】过量表达TsIPK2基因能够通过增强水稻的渗透调节能力、抗氧化胁迫能力并调节胁迫相关基因的表达,以提高水稻的耐盐性。     

植物的冷诱导基因（综述）

本文讨论了近年来利用分子生物学方法分离鉴定的抗寒锻炼相关基因（冷诱导基因）、其编码蛋白质的生理功能以及表达调节的分子机理。     

高温干旱共胁迫下外源甜菜碱和CaCl2对烟草生理响应的影响

以烤烟品种云烟85为材料,采用盆栽试验研究了对高温干旱共胁迫的反应,以及外源甜菜碱（GB）和CaCl2对烟草抗高温干旱共胁迫方面的作用。结果表明,叶面喷施GB和CaCl2能显著提高烟草植株生物量。在高温干旱共胁迫下,叶面喷施GB较蒸馏水处理能极显著提高烟草叶片叶绿素含量、SOD和POD活性,维持较高的脯氨酸含量及较低的丙二醛（MDA）含量和质膜相对透性;叶面喷施CaCl2较蒸馏水处理能极显著提高烟草叶片叶绿素含量、SOD和POD活性,极显著降低质膜相对透性,显著降低丙二醛（MDA）含量,维持较高的脯氨酸含量。高温干旱共胁迫恢复生长后,GB、CaCl2和蒸馏水处理的烟草其叶绿素含量、SOD和POD活性均有不同程度回升,丙二醛含量、脯氨酸含量、细胞质膜透性都有所下降。因此,GB和CaCl2对有效减轻双逆境胁迫引起的伤害,提高烟草的抗高温干旱胁迫能力具有积极的作用。     

水杨酸诱导下人参培养物差异表达基因片段的克隆

本研究以人参愈伤悬浮细胞为材料,在其生长的第28天添加1×10^-3mg／L水杨酸,测定水杨酸添加后,过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等3种酶在72h内的变化及皂苷含量,结果表明：水杨酸添加后对过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活力影响最大,分别在24h和48h达到最大峰值,在18h开始影响多酚氧化酶的活力,培养物生长的第28天添加水杨酸可以明显提高人参愈伤组织中皂苷的合成。确定添加水杨酸后24h提取总RNA,进行cDNA-RDA分析,筛选差异片段。确定差异基因并在GenBank中注册,注册号为FE900130。为探讨水杨酸作为诱导子对人参次生代谢的影响奠定基础。     

大白菜低温诱导基因COR30的转录表达

低温诱导某些与失水相关的物质表达，保护大分子物质避免受到过度失水的伤害。在为数众多的低温相关蛋白中，胚胎发育后期富集蛋白（LEA）是一类提高细胞对脱水忍耐性的蛋白。Dure et al．（1989）根据LEA蛋白的结构将其分为3类：第1类是成熟蛋白（Em）；第2类是ABA应答蛋白（RAS）和脱水蛋白；其余为第3类。目前对脱水蛋白的研究较多（Borovskii et al．，2002，Lu et al．，2003）。     

几种菊科植物BADH基因同源片段的克隆与序列分析

利用PCR-Southern的方法对菊科26个种和2个菊花（Dendranthema × grandiflora ）栽培品种的甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因进行了检测,其中18个种和2个栽培品种呈现明显的阳性信号。对其中7个种和1个栽培品种的PCR产物进行了测序（GenBank登录号：EF683587- 683595）,其中旋覆花中获得两个长度差异较大的序列。序列分析表明：在被克隆的基因片段中,外显子的长度在各种间是一致的,且同源性在83%以上,推测的氨基酸序列的同源性在90%以上,其中旋覆花长片段中保守十肽的第二个氨基酸由苏氨酸变异为丙氨酸。各序列内含子的长度差异较大,泽兰（Eupatorium lindleyanum）、祁州漏芦（Stemmacantha uniflora）、旋覆花（Inula japonica）长片段的内含子之间,及与其它序列的内含子之间均无明显的同源性,而其它序列的内含子间则表现出较高的同源性,且由内含子所反映的基因间的系统关系与外显子反映的系统关系基本一致。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）乙醛脱氢酶基因的特征分析

尖孢镰刀菌是木质纤维素生物转化乙醇极具潜力微生物菌种。对尖孢镰刀菌基因组中乙醛脱氢酶的研究有助于对其乙醇代谢途径和机理掌握。通过对尖孢镰刀菌基因组数据库的搜索,发现了23条假定乙醛脱氢酶,它们属于醛脱氢酶超家族,并根据其蛋白分子质量大小进行了系统命名。研究分析了这些蛋白的等电点、催化位点、磷酸化位点、亚细胞定位,进行了多序列比对和系统发育树构建,并获得了一条乙醛脱氢酶基因的核苷酸序列,这为尖孢镰刀菌乙醛脱氢酶基因的功能验证及乙醇代谢机理研究奠定了基础。     

西兰花表皮特异硫蛋白基因的克隆与表达分析

表皮特异硫蛋白在硫代葡萄糖苷代谢调控中起着重要作用,包括催化异硫氰酸酯生成环腈类和腈类物质。本研究以西兰花为试验材料,在克隆表皮特异硫蛋白基因BoiEPS的基础上进行序列分析和表达分析,并初步明确其在野油菜黄单胞菌侵染下的功能。结果表明,BoiEPS基因全长1 270 bp,有1个长度为238 bp的内含子;编码区全长1 032 bp,编码343个氨基酸,编码蛋白具有2个Kelch结构域。系统发育分析结果表明,BoiEPS与来自芜菁、甘蓝型油菜的EPS聚为一组,但与其他十字花科植物的EPS处于不同分支。实时荧光定量PCR结果表明,BoiEPS的表达受野油菜黄单胞菌的诱导,在24 h的表达量最大;BoiEPS的过量表达可显著提高西兰花对黑腐病的抗性,病程相关蛋白基因BoPR1的表达量在3个过表达株系均明显增加。本研究结果为后续开展西兰花-黑腐病抗性机理研究奠定了理论基础。     

青花菜乙烯反应传感蛋白基因BoERS的克隆与表达分析

乙烯反应传感蛋白在乙烯信号转导中起着重要作用,可作为负调控因子使下游的CTR1失活,并激活之后的一系列反应。为明确青花菜ERS基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆乙烯反应传感蛋白基因BoERS的基础上进行表达分析,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,BoERS的基因组DNA全长为1 928 bp,含有1个长度为68 bp的内含子;编码区全长为1 860 bp,编码619个氨基酸,编码蛋白有4个跨膜结构域、1个GAF结构域和1个HisKA结构域。序列比对结果表明,BoERS与芸薹属ERS序列的差异最小,在系统发育树上处于同一分支,但与萝卜属、盐芥属和拟南芥属植物ERS序列的差异较大,在系统发育树上处于不同的分支。实时荧光定量PCR结果表明,BoERS的表达受核盘菌的诱导,36 h时表达量最大,为对照的3.53倍,但BoERS的表达不受根肿菌的诱导。本研究结果为进一步开展BoERS基因功能鉴定和应用研究奠定了理论基础。     

杏山梨醇脱氢酶基因克隆及其在果实发育过程中的表达与酶活性分析

为研究杏山梨醇脱氢酶(SDH)的基因序列特征、在杏果实发育过程中的表达及其酶活变化,以金太阳杏为试验材料,采用同源克隆的方法克隆杏NAD+依赖的SDH编码基因的cDNA序列,命名为PaSDH,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析PaSDH在杏果实发育过程中的表达水平,检测酶活变化.序列分析结果表明,PaSDH...     

水稻干尖线虫海藻糖酶Ab-tre-1基因克隆与逆境条件下的表达分析

海藻糖酶参与生物体内能量代谢,在抵御逆境胁迫过程中发挥关键作用。水稻干尖线虫是水稻上重要的寄生线虫,能够在多种逆境中存活,严重危害水稻生长。为探究水稻干尖线虫海藻糖酶基因的功能,利用RACE-PCR技术获得了该线虫海藻糖酶基因全长,将其命名为Ab-tre-1,并利用实时荧光定量PCR技术分析在线虫卵、不同龄期和若干逆境条件下该基因的表达情况。结果表明,该基因DNA序列长2 083bp,包含9个内含子,开放阅读框1 743 bp,编码580个氨基酸,含有2个典型的海藻糖酶标签基序。进化树结果表明,水稻干尖线虫海藻糖酶与自由生活线虫和动物寄生线虫位于不同进化分支。Ab-tre-1在线虫卵中的表达最高,二龄幼虫和成虫次之,三、四龄幼虫表达水平较低。此外,当水稻干尖线虫暴露于干燥、活性氧、高温和药剂胁迫环境中,Ab-tre-1表达水平均显著提高,表明该基因可能与水稻干尖线虫的抗逆过程有关。本研究结果为阐明水稻干尖线虫海藻糖酶基因抗逆表达提供了理论依据。     

乌珠穆沁羊成肌细胞的诱导分化及相关基因表达

成肌细胞(myoblast cell)是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞,具有自我更新和促进肌纤维再生的能力,是体外研究肌肉发育调控机理的理想载体。本研究采取成年乌珠穆沁羊(Ovis aries)的背最长肌组织,结合使用胶原酶消化和差速贴壁两种方法分离纯化羊成肌细胞,并应用CCK-8法检测细胞生长曲线,苏木素-伊红染色与定量PCR检测成肌分化效果。结果显示,分离的细胞接种到培养瓶中24h后,高折光性亮圆形细胞开始贴壁,少量细胞有小突起。培养48h后,出现大量长梭形细胞,部分细胞伸出突起呈星型,细胞胞浆丰富。细胞生长曲线显示,成肌细胞符合正常生长规律,细胞传至第三代后用于CCK-8试剂盒检测,经分析后发现细胞符合正常生长规律,生长曲线近似S形,3d后开始进入对数生长期,第3~8天增殖迅速,第8天后细胞增殖速度减缓,第9天基本进入平台期。成肌诱导5d后,大量成肌细胞开始从单个核期进入合体细胞阶段,融合成核位于中央的多核性长竹状初生肌管。随后逐渐规律性地沿一个方向平行排列,形成多核的肌管。定量PCR结果显示,MSTN(myostatin)、FST(follistatin)、BTG2(B-cell translocation gene2)与BTG3(B-cell translocation gene3)在成肌细胞分化过程中有不同程度表达,存在阶段特异性。MSTN与FST随分化时间推移表达量逐渐降低,但FST基因表达量显著高于MSTN基因(P<0.05);分化期成肌细胞的BTG3表达极显著高于未分化期(P<0.01),而BTG2的表达则显著低于细胞未分化状态(P<0.05)。研究结果提示,本研究分离的羊成肌细胞具有肌源性,可分化为肌管;BTG2与BTG3两基因呈相反趋势表达,可能说明基因在肌肉发育过程中起不同作用。     

青花菜锌指蛋白基因BoCCCH1的克隆和表达分析

CCCH锌指蛋白广泛存在于真核生物中,在植物的生长、发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。为获知青花菜CCCH转录因子基因的序列特征和表达特性,从青花菜叶片中克隆到1个CCCH基因,命名为Bo CCCH1,同时,利用RT-PCR方法研究了其在不同器官及霜霉菌侵染叶片中的表达模式。序列分析结果表明,Bo CCCH1的基因组全长为1 568 bp,包含1个长度为599 bp的内含子,2个长度分别为627 bp、342 bp的外显子,编码322个氨基酸,蛋白质的分子量与等电点分别为35 296.42 Da和8.47;Bo CCCH1有2个锌指结构,类型均为C-X8-C-X5-C-X3-H。系统发育分析结果表明,Bo CCCH1与其它植物的21条同源序列在进化树上分为6组,来自十字花科的CCCH与Bo CCCH1处于同一分支。基因表达结果表明,Bo CCCH1在叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中表达,其中花茎和嫩角果的表达量最高,但在根中未检测到表达;在霜霉菌侵染下,叶片Bo CCCH1的表达量升高,到24 h和36 h时达到最大,推测Bo CCCH1与霜霉病抗性相关。本研究为进一步探明Bo CCCH1在霜霉病抗性反应中的功能奠定了基础。