一株对马铃薯瓢虫幼虫有特异活性的苏云金芽孢杆菌新菌株的研究

苏云金芽孢杆菌WZ-9是本室从河北省土壤中分离的对马铃薯瓢虫的幼虫有特异杀虫活性的新菌株，本文对该菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等方面进行了研究。结果表明该菌株可产生菱形伴孢晶体，SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa，生长周期是24h，随菌株的生长培养基pH值发生变化；生物活性测定表明该菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72h校正死亡率达100%，LC50为2.95×107细胞/mL；基因型鉴定表明含有cry7基因，获得了一条总长为3781bp基因序列，其中包含了一个3414 bp的开放读码框，其编码的蛋白由1138个氨基酸残基组成，与Cry7Ab2具有99.65%的序列同源性，存在4个氨基酸差异，亲缘关系最近，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3( 登录号为BI 1015188) 。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-21b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成,推导的分子量为81.2kD。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白,是一种新的Cry1Ia蛋白,该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明:Cry1Ia8对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50分别为0.268μg/g和2.227μg/mL,其杀虫效果与Cry1Ab和Cry1Ac相当。对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)也有较好的活性,但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲(Pyrrhalta aenescens)没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源,为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了重要依据。     

苏云金芽胞杆菌Cry1Ab毒素domainⅡ内3个loop对其毒性作用的影响

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry毒素domainⅡβ-折叠顶端的3个loop在靶标昆虫中肠受体识别中有重要作用,这3个loop在影响Cry毒性中起到的重要性有所不同。本研究利用能够与Cry毒素非靶标的豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)中肠氨肽酶N(amino peptidase N,APN)受体结合的短肽GBP3.1对Cry1Ab蛋白domainⅡ内3个loop分别进行替换,通过检测loop替换后3株改造蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫的毒性变化来分析3个loop在Cry1Ab毒性功能中的重要性差异。生物测定结果显示,与野生型Cry1Ab的LC50=0.88μg/m L相比,loop 1、2和3分别被替换后的Cry1Ab的LC50为12.17、32.25和23.00μg/m L。由此可见,loop 2在Cry1Ab杀虫活性中起到的作用最大,loop 3次之,loop 1对Cry1Ab毒素的毒性作用影响最小。该结论与Cry1A蛋白的三维空间结构分析相吻合,并为进一步了解Bt Cry1A毒素作用机制及其三维结构中功能域的研究提供了依据。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物，以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因，插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成，推导的分子量为81.2kDa。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白，是一种新的Cry1Ia蛋白，该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明：Cry1Ia8对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、小菜蛾（Plutella xylostella）有很强的杀虫活性，LC50分别为0.268 µg/g、2.227 µg/ml，其杀虫效果与Cry1Ab、Cry1Ac相当。对大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）也有较好的活性，但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲（Pyrrhalta aenescens）没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源，为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了极为重要的依据。     

苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。     

CrylAb敏感和抗性亚洲玉米螟氨肽酶N基因的克隆及序列差异分析

研究亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对Cry1Ab产生抗性的分子机理,对今后制定和实施合理的抗性治理策略具有重要的意义。本研究通过PCR方法克隆和测序,鉴定了Cry1Ab敏感-抗性亚洲玉米螟幼虫中肠氨肽酶N(APN)基因家族的一个成员Ofapn3,其cDNA全序列长3591bp,开放阅读框包括3045bp,编码1014个氨基酸。预测蛋白质分子量为115.1kD,等电点(pI)为4.44。其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶典型结构特征,即N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽,谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXHX18E,C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。系统分类归为第3支系。与欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的Onapn3(GenBank登录号:ABL01483)同源性为96.6%。与Cry1Ab敏感亚洲玉米螟cDNA相比,抗性品系的开放阅读框中有40个碱基发生了点突变,导致氨基酸序列中有10个氨基酸改变。其中Ser735在抗性品系中突变为Pro的现象在抗性棉铃虫APN3的氨基酸突变中也被检测到。鉴定的Cry1Ab敏感和抗...     

用合成多肽为半抗原制备Bt Cry1Ab的单克隆抗体

由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa14基因的分离、克隆及其表达

Bt25是中国自行分离的对小菜蛾(Plutella xylotella)具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),经PCR-RFLP鉴定含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,以Bt25质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因。序列测定结果表明,该基因编码区为3552bp,编码1183个氨基酸,分子量为133．7kD,pI4．755。该基因序列已在GenBank注册,登记号为AY197341,并获得正式命名cry1Aa14。在氨基酸序列918～1180间,和已知的11种cry1Aa存在22-23个氨基酸的差异(其中1094～1097的4个氨基酸无对应序列),而这段区域和Cry1Ab氨基酸序列的对应区域无差异。cry1Aa14全长基因插入Bt表达载体,获得了重组表达质粒pBYB1,转化Bt无晶体突变株HD73cry-,经过抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实转化成功。SDS-PAGE分析表明,该基因在上述受体中能正常表达133kD蛋白。杀虫生物测定结果表明,cry1Aa14表达产物对小菜蛾幼虫具有显著的毒杀作用,与cry1Aa12进行比较,毒力无明显差异。这种单基因菌株的发现及其基因的获得,为害虫抗性研究和高效工程菌的构建提供了重要实验材料。