抗Ⅰ型糖尿病融合基因HSP65-6×P277在烟草中的表达

为了研究抗Ⅰ型糖尿病融合蛋白质基因HSP65-6×P277在植物中的表达,构建了含有融合基因HSP65-6×P277的植物表达载体pCAMBIA2301-HSP65-6×P277,通过农杆菌介导法将重组载体转入烟草,利用卡那霉素作为植物筛选标记,获得含有抗Ⅰ型糖尿病基因的16株转基因烟草植株。通过PCR、半定量RT-PCR及SDS-PAGE蛋白质电泳等方法检测,初步验证在抗性烟草植株中融合基因HSP65-6×P277在mRNA和蛋白质水平上进行了表达。     

Expression of anti-type I diabetes fusion gene HSP65-6×P277 in tobacco

为了研究抗Ⅰ型糖尿病融合蛋白质基因HSP65-6×P277在植物中的表达,构建了含有融合基因HSP65-6×P277的植物表达载体pCAM BIA 2301-HSP65-6×P277,通过农杆菌介导法将重组载体转入烟草,利用卡那霉素作为植物筛选标记,获得含有抗Ⅰ型糖尿病基因的16株转基因烟草植株.通过PCR、半定量RT-PCR及SDSPAGE蛋白质电泳等方法检测,初步验证在抗性烟草植株中融合基因HSP65-6×P277在mRNA和蛋白质水平上进行了表达.     

重组细胞色素P450 BM-3酶的表达条件及初步纯化研究

对重组细胞色素P450 BM-3基因工程菌的培养条件进行了单因素优化,确定了较佳的P450BM-3培养和表达条件:接种量1%,装液量100 mL/500 mL,发酵培养基加入0.1 mg·L-1FeCl3,OD578达到1.0左右时升温至42℃诱导,诱导时间为5 h.考察了DEAE-Sepharose FF与Resource Q 2种阴离子介质对分离纯化P450 BM-3的影响.结果表明,Resource Q纯化效果优于DEAE-Sepharose FF,通过AKTA explorer100对Resource Q分离条件进行了优化,0.3 mol·L-1、0.5 mol·L-1的两步NaCl阶跃洗脱,P450 BM-3纯度较高,活性收率为30.1%,纯化倍数为2.12.     

人TroponinⅠ的表达载体构建诱导表达和纯化及活性测定

以人肝脏cDNA文库为模板，通过PCR方法扩增出Troponin基因，将其克隆到pCR-TOPO质粒中，构建表达质粒pET-22b（＋）-TnⅠ，转化大肠杆菌BL21（DE3）-RPX并进行诱导表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20％以上并主要以可溶形式存在。建立了TroponinⅠ的非亲和色谱纯化工艺，纯化后蛋白产量约为20mg／L．纯度在90％以上。体外活性实验表明重组蛋白具有良好的抗血管生成。     

烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化

[目的] 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道.为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础.[方法] 采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟(Nicotia...     

重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化

将重组大肠杆菌pC6-BL21活化后,用IPTG诱导表达,探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件。结果表明,菌株在37℃,接种量为2%,摇瓶培养3.0 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30℃诱导5.0 h,收获的蛋白产量最高,经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白,Western blotting分析显示该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力。     

灰霉菌MyosinⅠ的体外表达纯化及抑制剂筛选

[目的]本文旨在体外表达纯化灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ)及筛选抑制剂。[方法]采用SF9昆虫细胞蛋白表达系统表达灰霉菌MyosinⅠ(BcMyosinⅠ)马达结构域,用亲和层析和凝胶过滤层析纯化方法纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。从实验室已有的化合物库中,用ATPase活性试剂盒测定化合物对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率。采用菌丝生长速率法测定部分化合物对灰霉菌的菌丝生长抑制活性。以禾谷镰刀菌Ⅰ型肌球蛋白(FgMyosinⅠ)三维结构为模板,同源模建预测BcMyosinⅠ三维结构。用AutoDock-Vina软件将部分化合物与BcMyosinⅠ进行分子对接。[结果]成功在体外表达纯化BcMyosinⅠ。20μmol·L^-1条件下,化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率分别为56.24%和65.39%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对酶活性的抑制率(27.29%);B1和B17对灰霉菌的菌丝生长抑制率分别为32.90%和83.44%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对菌丝生长的抑制率(1.06%)。对照药剂氰烯菌酯与...     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立

为建立新孢子虫病间接酶联免疫吸附试验(rELISA)检测方法,先诱导表达GST-P43包涵体蛋白,并对其进行提取、纯化、复性处理,再以复性后的P43蛋白作为抗原,优化rELISA检测方法。结果表明,这种包涵体处理方法,可使其纯度达到87%,复性后的目的蛋白具有良好的免疫活性。通过对rELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件,血清稀释倍数为1∶100,抗原包被浓度为7μg/mL,封闭液为0.5%脱脂乳,酶标抗体的工作浓度为1∶4000,酶标抗体作用时间为1 h,底物作用时间25 min。且该方法不与弓形虫和布鲁氏菌病发生交叉反应。     

微管相关蛋白2微管结合区基因的克隆与表达

为了研究微管相关蛋白2(M AP 2)在促进微管形成、维持微管稳定及促进轴突和树突细胞器转运等方面的作用,试验克隆了M AP 2微管结合区基因,构建了原核表达载体pET 32a-M AP 2并对其进行诱导表达,利用亲和层析法对表达产物进行纯化,研究了表达产物与微管蛋白之间的作用。结果表明,融合表达的人M AP 2微管结合区蛋白约43 ku,可与天然的微管蛋白发生分子间的结合作用,为M AP 2生理功能的研究奠定了基础。     

抗菌肽CMIV在大肠杆菌中的表达与纯化

用PCR定点突变技术将改造的家蚕抗菌肽CMIV引入6×His·Tag序列,构建大肠杆菌硫氧还蛋白融合型表达载体pTrxFus-CMIV,转化GI724得到阳行Ni2 预装柱进行"一步纯化法"分离及纯化,得到了重组的抗菌肽.纯化产物与经过非变性凝胶电泳目的带的电洗脱、脱盐、肠激酶切割后、初步抑菌实验的结果一致.试验结果为以后的研究和生产奠定了基础.     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其酶活测定条件优化

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。     

初沉单元中净化材料的筛选及运行参数研究

为了对养殖尾水处理系统中沉淀单元净化能力进行优化,以净化前后养殖尾水总氮（TN）、总磷（TP）和高锰酸钾指数（COD_Mn）为检测指标,对除磷型改性凹凸棒土（Al@TCAP-P）、除氮型改性凹凸棒土（Al@TCAP-N）、陶粒砂、细菌屋、火山石、吸氨石和活性炭等7种净化材料进行筛选,以研究其最佳添加量和最佳分布方式。结果表明：从整体上看,Al@TCAP-N对TN去除,火山石对TP、COD_Mn去除效果较好。Al@TCAP-N可在正常沉淀基础上提升36% TN去除率,平铺时去除效果最佳;火山石可提升34%的TP去除率和15%的COD_Mn去除率,堆积时净化效果最佳。Al@TCAP-N和火山石有利于提升沉淀单元净化效能,最佳添加量分别为5.24 g·L^-1和5.02 g·L^-1。     

抗菌肽Lactoferricin B的原核表达及其纯化

牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B,LfcinB)是一种阳离子型抗菌肽,因其具有多种生物学功能,现已被认为具有能够替代传统抗生素的发展前景。然而,由于传统的分离制备方法存在诸多弊端,所以基于基因工程的原核表达技术在制备高纯度和高效表达的该蛋白方面具有极其深远的意义。研究旨在摸索出一套完整的利用原核表达技术制备LfcinB的分子生物学方法。依据大肠杆菌密码子偏爱性的原则,设计了LfcinB的基因序列,通过人工合成的方法获得该基因的优化序列,借助Bam HI和Sal I双酶切、连接等手段将其构建到原核表达载体pGEX-4T-2上,获得重组表达载体pGEX-4T-2-LCB,将该载体转化E.coli Rosetta(DE3)。使用IPTG诱导,结果发现LfcinB在大肠杆菌中表达量超过20%。通过一系列蛋白纯化技术分离得到纯度达到95%以上的LfcinB融合蛋白。抑菌试验结果表明,重组抗菌肽LfcinB融合蛋白具有很好的抑菌活性。研究结果为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。     

鼻咽癌ras P21蛋白表达的临床意义

目的探讨鼻咽癌ras P21蛋白表达的临床意义.方法采用流式细胞术和单克隆技术对鼻咽鳞状细胞癌细胞ras P21蛋白表达进行定量检测,并与正常细胞对照.结果ras P21蛋白表达量与鼻咽癌的恶性程度呈正相关.随着鼻咽癌恶性程度的增加ras P21蛋白表达量也增加,但是与临床分期及患者的生存期无关.结论ras P21蛋白表达对鼻咽癌的筛选和早期诊断具有重要意义     

重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化 

以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。     

无指盘自蛙皮肤分泌液中促胰岛素释放肽的分离纯化与活性初步研究

通过葡聚糖 Sephadex G-50凝胶过滤和反相高压液相层析等手段,对无指盘臭蛙皮肤分泌液进行分离纯化,得到了高纯度的多肽分离峰.分别采用体外培养的大鼠胰岛和INS-1胰岛β细胞系检测分离峰的促胰岛素释放活性.结果表明,所得多肽既可促进原代培养的大鼠胰岛分泌胰岛素,又可以促进INS-1细胞胰岛素释放;运用飞行质谱仪测定该促胰岛素释放肽的相对分子质量,其大小为1 868.此外,利用鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)体内模型检测,发现该多肽还具有显著的抑制血管生成活性.     

无指盘臭蛙皮肤分泌液中促胰岛素释放肽的分离纯化与活性初步研究

通过葡聚糖Sephadex G-50凝胶过滤和反相高压液相层析等手段,对无指盘臭蛙皮肤分泌液进行分离纯化,得到了高纯度的多肽分离峰。分别采用体外培养的大鼠胰岛和INS-1胰岛β细胞系检测分离峰的促胰岛素释放活性。结果表明,所得多肽既可促进原代培养的大鼠胰岛分泌胰岛素,又可以促进INS-1细胞胰岛素释放;运用飞行质谱仪测定该促胰岛素释放肽的相对分子质量,其大小为1868。此外,利用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）体内模型检测,发现该多肽还具有显著的抑制血管生成活性。