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CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。 相似文献
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为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术,已成功应用于多种物种,例如,人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。 相似文献
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由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中,是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割,因此从2013年起,CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术,CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命,并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而,CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题,这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。因此,近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理,并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9创造早熟香味水稻 总被引:2,自引:0,他引:2
《土壤与作物》2017,(2)
黑龙江省是我国最大的水稻种植区,近年来水稻种植面积不断增加,为加快高纬度、低积温的地区品种选育进程,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对第二积温带主栽品种绥粳14的抽穗期基因Hd2、香味基因Badh2进行编辑。通过T_1代的分子鉴定,Hd2和Badh2基因被敲除而且基因型纯合。田间鉴定表明,转基因抗性标记也被成功剔除的两个株系,绥粳14-d1和绥粳14-d2,比绥粳14提早13天左右。利用咀嚼法、氢氧化钾浸泡法和气相色谱-质谱联用技术(GCMS)测定香味,结果显示绥粳14-d1和绥粳14-d2中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量显著高于绥粳14。综合以上结果,本研究利用基因编辑技术,成功获得了改良的抽穗期缩短香米品种,为早熟、优质水稻品种的选育提供了理论指导,加速了育种进程。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区 总被引:1,自引:0,他引:1
斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39%.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具. 相似文献
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为建立一套可操作性强、广谱性强、高效的基因编辑辣椒遗传转化体系,以辣椒B2为试验材料,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)和载体质粒pCas9-TPC按质量比1:1复合30 min后,加入混有辣椒花粉的培养基中,于MagnetoFACTOR plate24磁板下室温放置30 min,在磁场作用下导入花粉。将携带CRISPR/Cas9基因载体的花粉进行人工授粉,果实成熟后收获种子。通过载体质粒DNA上携带的抗除草剂(草铵膦)抗性标记,检测转化情况。提取T0代植株的DNA和RNA及T2代DNA,以pCas9-TPC为模板设计引物进行PCR扩增,检测T0和T2代植株中是否存在pCas9-TPC载体,对T0代植株进行Southern杂交检测基因编辑载体与辣椒基因组的整合情况。结果显示,平均转化效率约为63.70%,PCR检测显示T0代植株DNA和RNA及T2代DNA均扩增出CRISPR/Cas9载体,随机选取8株阳性植株进行Southern杂交,随机出现1~3条条带。本研究表明纳米磁性颗粒介导的花粉转化法可以在辣椒上建立高效的基因编辑转化体系,为辣椒的遗传育种提供更好的工具。 相似文献
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高通量下水稻育种网络信息管理系统 总被引:1,自引:1,他引:0
高通量水稻种植试验以及表型现象检测是水稻分子遗传育种研究中的重要步骤。针对种植试验中容易大量存在的育种信息记录错误、延迟、整合繁琐、查询困难、共享不便等问题,设计了基于RFID、数据库和网络技术的水稻育种网络信息管理系统。该系统以水稻种植试验为研究对象,通过RFID电子标签实现水稻盆栽的实时标识;建立网络信息管理系统对种植水稻信息进行远程访问和操作;并针对水稻突变体库的多代种植,提出了水稻种植家系可追溯的数据管理方法,实现水稻家系的自动追溯和家系树的自动生成。种植区试验证明系统能可靠记录入场水稻盆栽信息,并有出错提示功能;能实现水稻盆栽在种植区位置的自动分配及跟踪管理。系统远程访问、操作,管理正常运行,有效地提高了水稻遗传育种试验的效率。 相似文献
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NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应(overlapping PCR)法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆(golden gate)方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。 相似文献
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促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T1植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。 相似文献
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非洲栽培稻作为重要的水稻种质资源,其基因渗入系可以为普通栽培稻的遗传背景提供新的有利基因,如果能将这些优良基因引入普通栽培稻中,可为水稻分子设计育种提供新的基因资源。本研究以非洲栽培稻基因渗入系YIL60与轮回亲本中9B(Z9B)杂交衍生的包含188个株系的F2和F2:3群体为材料,对粒形性状包括粒长、粒宽、籽粒长宽比、千粒重,剑叶形态性状包括剑叶长、剑叶宽进行数量性状点位(QTL)检测。结果共检测到16个QTL,包括2个粒长QTL、3个粒宽QTL、2个籽粒长宽比QTL、2个千粒重QTL、1个剑叶长QTL、6个剑叶宽QTL,分布于第1、第6、第7、第10和第11号染色体上,贡献率为2.25%~25.64%;有4个多效性QTL区间,有4个QTL qGW7-1、qFLL10、qFLW10、qTGW7在F2和F2:3群体中被重复检测到,其中在第7号染色体RM3859-RM3394区间检测到同时控制粒长、粒宽、籽粒长宽比和千粒重的QTL,贡献率最高达17.10%,是一个来源于非洲栽培稻的新粒形QTL。本研究为进一步开展粒形、剑叶形态性状基因的精细定位、克隆和分子标记辅助育种工作奠定了一定的理论基础。 相似文献
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水稻耐盐生理及分子调节机制 总被引:1,自引:0,他引:1
土壤钠盐积累导致的土壤盐渍化程度越来越严重,已成为制约水稻产量和品质的重要因素之一。钠离子是引起水稻盐胁迫伤害的主要离子,研究钠离子在水稻植株体内的吸收运输机制,及水稻应对盐胁迫的生理分子调节机制,有助于抗盐品种的选育以及盐碱地的综合治理与利用。本文综述了水稻对盐信号的感应及盐分在水稻体内的吸收转运特征;分析了盐分进入水稻机体后对植株形态及生长发育的影响;探讨了水稻为缓解盐分伤害,诱发的渗透调节、养分、抗氧化系统、激素等生理调节机制,以及通过抗逆蛋白差异性表达和耐盐相关基因应激表达,来控制水稻体内离子平衡,保护膜系统及光合系统的分子调节机制。同时,本文对提高水稻耐盐性提出了外源调控措施,并对该领域的研究进行了展望。 相似文献