羊附红细胞体解离方法的比较研究

本试验为建立一种高效的羊附红细胞体解离方法,采集红细胞感染率大于90%的阳性抗凝血,分别应用水浴法和药物体外驱虫法对羊附红细胞体进行解离,观察分离前后附红细胞体感染率、红细胞感染强度、附红细胞体数、杂质含量和附红细胞体的运动性5项指标;提取附红细胞体抗原,制备全蛋白悬液,测定蛋白质含量,比较解离效果。将两种方法制备的羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE试验,观察条带是否一致。结果显示,200 mL血液中加入1 mL双向红莲灭,4℃作用36 h,即可达到较好分离效果。与水浴法相比,解离后,红细胞感染率和感染强度明显下降,蛋白含量增加,收率高,纯度好。SDS-PAGE结果显示,体外驱虫法所制的羊附红细胞体抗原全蛋白悬液,其抗原蛋白带与水浴法相同,因此可用于粗制羊附红细胞体抗原。     

羊附红细胞体解离方法的比较研究

羊附红细胞体病对羊群有一定的危害性,本文将展开对羊附红细胞体解离方法的研究。为了能够得到准确的实验结果,首先要获取红细胞感染率较高的阳性抗凝血作为实验样品,使用多种方法对红细胞体进行解离,然后比较这几种方法对羊附红细胞体的解离效果。主要采用SDS-PAGE方法检测。结果显示,在针对羊附红细胞体解离方法当中,在200m L的抗凝血液当中加入1m L的双向红莲灭,保持在4℃左右的情况下,36h后会有比较好的分离效果。传统的水溶法,其解离的效果会比较差,但可明显降低羊附红细胞的感染率及感染的强度,效率也比较高。希望能够通过本文的研究,为业界提供更多的参考。     

牛附红细胞体LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛附红细胞体检测方法,本研究根据GenBank上发表的16S rRNA基因(登录号:AF016546)序列设计合成2对LAMP特异引物,建立了检测牛附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。LAMP扩增产物经电泳、显色鉴定。结果显示,LAMP方法扩增牛附红细胞体产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光;敏感性检测最低浓度为25.6 fg/μL;特异性试验结果显示,牛附红细胞体检测管显色后呈阳性,而猪附红细胞体、牛新孢子虫、弓形虫及牛瑟氏泰勒虫等对照组均呈阴性,说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛附红细胞体的检测。     

附红细胞体病

<正>附红细胞体病是由附红细胞体寄生于猪红细胞和血浆中而引起的一种传染性疾病,临床以发热、厌食、贫血、黄疸及四肢、耳尖和腹下出血为主要特征,易感动物有猪、牛、羊、猫和其他动物,在不同宿主中存在不同的虫种(如猪附红细胞体、羊附红细胞体)。人也可感染附红细胞体。近年来猪附红     

家畜附红细胞体病

附红细胞体病是附红细胞体寄生于动物红细胞内、红细胞表面及血浆中而引起的一种传染病。该病原体为立克次氏体目、无浆体科、附红细胞体属。目前国内外已发现马、骡、驴、牛、羊、猪、狗、兔、猫、鼠、鸡等多种畜禽患附红细胞体病。我县已     

进口澳大利亚奶牛附红细胞体的发现与诊断

在对从澳大利亚进口的奶牛进行入境隔离检疫时，发现了牛附红细胞体病，感染率100％（1363／1363），其中：体况较肥的牛血液中30％－50％的红细胞感染附红细胞体，瘦弱牛，极度消瘦的牛血液中60％－80％以上的红细胞感染附红细胞体，使用贝尼尔3．5毫克／千克体重治疗效果较好，在广西是首次从澳大利亚进口的奶牛中发现附红细胞体病。     

牛附红细胞体16SrRNA基因的克隆测序及分析

无菌采集自然感染附红细胞体的牛血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1 500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析.结果,所克隆的牛附红细胞体基因片段大小为1 454 bp,GenBank登录号为FJ375309(丰都株).序列比对结果显示,牛附红细胞体丰都株与武汉株(AY946266)最高,达99.7%,与支原体科代表种同源性为60.7%～76.2%,而与立克次氏体科的立克次氏体和无形体科的无形体同源性仅为51.4%～56.4%,表明牛附红细胞体应归为支原体科,附红细胞体属,而不应属于立克次氏体目,无浆体科.对国内外牛温氏附红细胞体的亲缘关系分析表明,牛温氏附红细胞体无明显的地域性差别趋势.     

进口澳大利亚奶牛附红细胞体病的发现与诊断

在对从澳大利亚进口的奶牛进行入境隔离检疫时，发现了牛附红细胞体病，感染率100%(1363/1363),其中，体况较肥的牛血液中30％－50％的细胞感染附红细胞体、瘦弱牛、极度消瘦的牛血液中60％－80％以上的红细胞感染附红细胞体。使用贝尼尔3．5毫克／千克体重治疗效果较好。在广西是首次从澳大利亚进口的奶牛中发现附红细胞体病。     

一例奶牛附红细胞体病的诊疗体会

牛附红细胞体病是牛附红细胞体之立克次氏体寄生于牛、羊、猪、人等多种动物细胞表面或血浆及骨髓中引起的一种溶血性传染病。其特征为高热、贫血、黄疸、消瘦。病原是一种寄生于血浆和红细胞的血液寄生虫。在油镜下观察，可以看到单个、数个寄生在红细胞表面和血浆内。采集血液涂片，经姬姆萨染色，红细胞呈粉红色，附红细胞体呈淡蓝色，多数为半月状。牛附红细胞体对干燥和化学药物抵抗力较弱，耐低温，一般常见消毒药均可将其杀灭。该病常发生于夏秋温暖季节，寒冷季节较少发生。这种病是由蚊虫及吸血昆虫传播的奶牛发病后如果得不到及时治疗，易继发其它疾病甚至会造成死亡。现就一起奶牛附红细胞体病的诊治情况报告如下：     

附红细胞体病及其混合感染的病例2则——病例一：黄牛附红细胞体病

牛附红细胞体病是牛附红细胞体之立克次氏体寄生于牛、羊、猪、人等多种动物细胞表面或血浆及骨髓中引起的一种溶血性传染病。其特征为高热、贫血、黄疸、消瘦。病原为一种寄生于血浆和红细胞的血液寄生虫。牛附红细胞体对干燥和化学药物抵抗力较弱．耐低温．一般常见消毒药均可将其杀灭。该病常发生于夏秋温暖季节．主要由蚊虫及吸血昆虫传播引起发病．寒冷季节较少发生。牛发病后如不及时治疗，会造成死亡，现将一起黄牛附红细胞体病的诊治情况介绍如下。     

奶牛附红细胞体的分类鉴定及诊断方法的建立

为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E．wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体（广西株，E．wenyoni-GX）进行16SrRNA基因的克隆及测序。并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1．5kbp的奶牛附红细胞体的16SrRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明。所建立的PCR方法与常见支原体、细菌及原虫元交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0．145fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。     

奶牛附红细胞体16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育进化树的建立

为了从分子水平上证实奶牛附红细胞体的存在及研究其分类学地位,利用原核生物16S rRNA基因通用引物对分离纯化的疑似奶牛附红细胞体进行16S rRNA基因的PCR扩增及克隆测序。结果扩增出长约1.5 kb的目的片段,测序结果表明:目的片段长度为1 439 bp,其核苷酸序列与国外已发表的牛温氏附红细胞体(E.wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高达97.1%,暂称为中国广西株(E.wenyoniCGX)。系统发育进化树显示:E.wenyoni和其他血营养菌在系统进化关系上组成了一个大的进化分支,与支原体科、支原体属的病原最接近(75%),而与立克次体科的病原较远(55%)。分析结果支持了Nei mark等和Messick等提出的将这类血营养菌划归支原体科、支原体属的建议。     

温氏支原体感染动物模型的建立

为促进温氏支原体的深入研究,本试验建立了温氏支原体感染动物模型。选择6～8周龄健康雄性昆明种小鼠60只,随机分为A、B、C、D 4组,试验组(A、B、C)分别以不同方式感染温氏支原体,D组为对照组。结果表明,腹腔注射一定剂量高感染强度的牛红细胞悬液,同时注射免疫抑制剂地塞米松组(C组)表现为首现期出现早,且高峰期红细胞感染率高。应用悬滴镜检法和PCR诊断方法对感染小鼠血样进行鉴定,均符合温氏支原体特征。选择对照组小鼠和感染率高、临床症状较为明显的C组小鼠各10只,进行血液生理生化指标测定(RBC、WBC、Hb、TP、G、ALT、AST),结果呈现出与牛感染温氏支原体相同的规律。     

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物，在其上游引物内侧叉设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体痛典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示，该反应阳性率为58．3％，低于临床解剖和镜检结果。对谈基因的序列测定结果进行分析，表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80％以上。从谈基因来看，附红细胞体与立克次氏体没有同源性，而与肺炎支原体和穿透支原体亲垮关系较近。     

Enzyme-linked immunosorbent assay using solubilised antigen for detection of antibodies toAnaplasma marginale

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect antibodies against Anaplasma marginale. A marginale bodies were separated from parasitised erythrocytes by a modified nitrogen decompression method, sonicated, then solubilised with Triton X-100 and used as the ELISA antigen. In this ELISA system the required amount of antigen protein was 16.2 ng for each well. In the course of experimental infections, of calves, significant antibody levels were detected by ELISA and the complement fixation test (CFT) at almost the same time. Antibodies against A. marginale were detectable for longer periods using the ELISA than using the CFT. Sera from calves infected with Babesia bigemina, B. bovis, B. ovata, Theileria sergenti and Eperythrozoon wenyoni gave no reaction; however, antisera against A. centrale did react with the A. marginale ELISA antigen.     

Use of a polymerase chain reaction assay to detect infection with Eperythrozoon wenyoni in cattle.

OBJECTIVE: To determine whether a polymerase chain reaction (PCR) assay could be used to detect Eperythrozoon wenyoni in the blood of cattle. DESIGN: Prospective study. ANIMALS: 95 cattle from various herds in Alabama and Georgia and 96 bulls enrolled in Auburn University's Alabama Beef Cattle Improvement Association Bull Test program. PROCEDURE: Blood samples were collected by means of venipuncture of the median caudal vein and submitted for a CBC and PCR assay. Blood smears were made immediately after blood collection and examined by means of light microscopy. RESULTS: Three of 95 cattle from herds in Alabama and Georgia and 5 of 96 bulls enrolled in the Bull Test program had positive PCR assay results. Organisms were seen in blood smears from only 5 of these 8 animals. Organisms were not seen in blood smears from any animals for which results of the PCR assay were negative. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: Results suggest that a PCR assay may be an effective method for detecting E wenyoni infection in cattle and that the PCR assay may be a more sensitive test than evaluation of blood smears.     

奶牛附红细胞体和伊氏锥虫二重PCR诊断方法的建立

为建立奶牛附红细胞体和伊氏锥虫两种病原诊断方法并探索二者之间在奶牛感染中的关系,本研究针对两病原分别设计两对特异性引物,建立了奶牛附红细胞体和伊氏锥虫感染的二重PCR诊断方法,其扩增片段大小分别为415bp和237bp。敏感性试验和特异性试验表明,附红细胞体和伊氏锥虫的DNA的最低检测量为0.154pg和0.105pg;与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应。35份临床血样检测结果为:奶牛附红细胞体阳性率22.89%,伊氏锥虫阳性率8.89%,其中共感染率为2.89%。临床试验表明,该方法可用于奶牛附红细胞体和伊氏锥虫的诊断,特别适用于早期诊断。     

Development of a recombinant Anaplasma marginale DNA probe

An Anaplasma marginale DNA probe has been developed by using an improved method for the isolation of genomic DNA. Purified genomic A. marginale DNA from the St. Croix isolate was partially digested with Sau 3A1 into fragments (greater than or equal to 5.0 kb). The restriction fragments were cloned using standard techniques in the pBR322 vector and used to transform E. coli (DH5) host cells. The recombinant A. marginale DNA library was screened by the colony lifting procedure. Colonies containing plasmids with A. marginale DNA inserts were identified by hybridization with a genomic A. marginale DNA radiolabeled probe (32P). Seven recombinant A. marginale DNA probes were evaluated by dot-blot in vitro hybridization assays to identify candidates as diagnostic tools in bovine anaplasmosis studies. Specificity and sensitivity experiments were carried out by using heterologous and homologous DNAs. The heterologous panel contained bovine DNA (WBC) and blood parasites DNA from Babesia bovis (Bb), Babesia bigemina (Bbi), Eperythrozoon suis (Es) and Eperythrozoon wenyoni (Ew). The homologous DNA panel included A. marginale DNAs of 12 different isolates which were isolated in the Caribbean, Mexico, and the U.S.A. The selected diagnostic probe was identified as pSt. Croix A1, and labeled with 32P by using in vitro nick translation and random primer techniques. The pSt. Croix A1 probe demonstrated 100% specificity and high sensitivity by hybridization in dot blotting and Southern blotting. The probe can detect 500-1000 infected erythrocytes per microliters which corresponds to a parasitemia of less than 0.01%. The A. marginale DNA insert was approximately 6.4 kb in size and a partial restriction map has been constructed.