番茄cry1基因果实特异性植物表达-载体的构建及其转化番茄的研究

隐花色素(cryptochrome)是一类对UV-A/蓝光作出应答的光受体.果实特异性植物表达载体是用在番茄果实中特异表达的Lefsm1基因的启动子(fsp)替换质粒pBI121原有的35S启动子构建而成(称为pBI121 fsp).将番茄隐花色素家族成员之一cryptochrome1中465 bp特异片段导入到植物栽体pBI121 fsp构建成果实特异性表达的RNAi植物表达载体(pBlI21fsp-cryI),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.为后续对CRY1与番茄果实中抗氧化剂番茄红素之间的关系研究提供了材料.     

金针菇启动子的基因克隆

利用PCR扩增技术,以金针菇菌丝总DNA为模板,扩增出一条长约750 bp的特异性gpd启动子基因条带(命名为gpd-Fv2),并将其连接到载体上,然后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选出阳性质粒。DNA序列与金针菇gpd启动子的同源性为98%。     

番茄rbcS3A启动子调控的外源基因在转基因番茄中的表达模式(英文)

[目的]研究番茄rbcS3A启动子调控的外源基因在转基因番茄中的表达模式。[方法]以PCR方法克隆番茄Rubisco小亚基启动子rbcS3A,并构建Rbcs3A-Gus嵌合表达载体p1300RG,将重组载体用农杆菌介导的方法导入到番茄中,最后通过对阳性苗进行Gus活性检测,分析rbcS3A启动子驱动的外源基因在番茄中的表达模式。[结果]试验获得15株PCR阳性苗,阳性苗的获得率为33.3%;Gus活性染色结果显示,番茄rbcS3A控制的外源基因能够在转基因番茄成熟的叶片中高效表达,在果实等生殖器官中表达较弱,在种子中不表达。[结论]调整后的试验方案更有利于获得阳性苗;证实了启动子rbcS3A能够驱动外源基因在番茄营养器官叶片中高效表达而在种子等生殖器官中不表达或表达极低。     

新疆3个不同品种牛SLC11A1基因启动子克隆及序列分析

[目的]溶质性载体蛋白家族成员1(SLC11A1)基因是一个主要的自然抗性候选基因,与多种胞内寄生病原菌的抵抗作用相关,研究克隆新疆褐牛、荷斯坦牛和西门塔尔牛SLC11 A1基因启动子序列,分析启动子序列差异,为奶牛抗病育种提供辅助选择的分子标记.[方法]分别采集新疆3个品种牛全血,提取基因组DNA,PCR扩增5'端启动子区,测序.利用生物信息学软件CpGplot、RepeatMasker、TFSEARCH、WWW SignalScan及双荧光素酶检测系统对获得序列进行分析.[结果]获得SLC11A1基因启动子片段1 463 bp,且具有启动子活性,未发现CpG岛的存在.新疆3个品种牛间SLC11A1基因启动子序列未出现差异,但与美国安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在4处差异.启动子区预测到SP1,NF1,RelA-p65,GKLF,CPBP等12个转录因子结合位点,并发现1个增强子区域(-734～-740),该序列存在两处短散的重复元件BOV-tA2、MIR3,以及重复DNA元件Charlie8.[结论]得到新疆地区3个品种牛SLC11A1基因启动子序列,并与安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在差异,为进一步研究SLC11A1基因多态性影响机体对胞内感染菌的抗性研究提供理论依据.     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

 利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

种子特异性启动子的研究进展

启动子是基因表达的重要顺式调控元件。对植物基因启动子的核心结构与功能、种子特异性启动子的结构特点、植物基因启动子克隆的方法、已经克隆的种子特异启动子及存在的问题进行了综述,并对该领域的发展趋势进行了展望。     

拟南芥rd29A基因启动子DNA片段的克隆、序列测定、分析

从拟南芥中分离到rd2 9A基因启动子DNA片段并克隆到 pMD 18克隆载体中 ,获得pRDP重组载体 ,将克隆测序 ,并对序列进行分析。     

Isolation and Characterization of E11 Gene Promoter from Tomato

A fragment of 2 000 bp upstream sequence of E11 clone was amplified from genomic DNA of the tomato cultivar Zhongshu5. Sequence analysis showed that the upstream contains the regulatory elements: TATA box (-29 - -22), CAAT box (-193- -189), wound, and drought response elements. Expression vectors of E11 promoter gus fusion were constructed with the promoters of 1 200 and 2 000 bp regions, respectively. Transgenic tomato plants were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Histochemical analysis of GUS activity in various tissues showed that the two promoters were able to direct fruit-specific gene expression. The expression driven by promoter of 2 000 bp upstream fragment could increase GUS activity with the maturation of tomato fruits. The promoter of -1 200 bp fragment could direct gus gene expression in fruits with the inductions of drought and wounding. The regulatory region for fruit-specificity was probably located in the region of 1200 bp of 5'-flanking sequence and some positive regulatory elements or enhancers may exist in the region from -1200 to -2000 bp.     

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

妃子笑荔枝LcSAI启动子的克隆及其生物信息学分析

[目的]酸性转化酶在荔枝糖代谢中具有重要作用,克隆和分析荔枝酸性转化酶基因(LcSAI)启动子,以期为LcSAI调控荔枝糖代谢的功能研究提供理论依据.[方法]以妃子笑荔枝果肉为材料,根据荔枝基因组序列信息,克隆LcSAI上游约1500bp的启动子序列,并利用生物信息学工具对启动子序列中的转录起始位点、顺式作用元件及Cp...     

Isolation and Characterization of Ell Gene Promoter from Tomato

A fragment of 2000 bp upstream sequence of Ell clone was amplified from genomic DNA of the tomato cultivar Zhongshu- 5. Sequence analysis showed that the upstream contains the regulatory elements： TATA box （-29 - -22）, CAAT box （-193 - -189）, wound, and drought response elements. Expression vectors of Ell promoter gus fusion were constructed with the promoters of 1 200 and 2 000 bp regions, respectively. Transgenic tomato plants were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Histochemical analysis of GUS activity in various tissues showed that the two promoters were able to direct fruit-specific gene expression. The expression driven by promoter of 2 000 bp upstream fragment could increase GUS activity with the maturation of tomato fruits. The promoter of -1 200 bp fragment could direct gus gene expression in fruits with the inductions of drought and wounding. The regulatory region for fruit-specificity was probably located in the region of 1 200 bp of 5′-flanking sequence and some positive regulatory elements or enhancers may exist in the region from -1 200 to -2000 bp.     

番茄WRKY基因的克隆与分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生物和非生物胁迫中起重要作用。以水杨酸诱导的番茄为材料,设计简并引物后进行RT-PCR扩增,得到4个含有WRKY结构域的EST。选择其中之一,采用同源克隆的方法扩增出WRKY基因的全长。半定量PCR分析结果表明,400 mmol/L NaCl、4℃低温胁迫后该基因表达量发生变化,说明其可能与番茄的耐盐性和耐低温性有关。     

番茄同源四倍体离体诱导研究

[目的]利用组织培养技术与秋水仙素相结合进行番茄四倍体的离体诱导研究。[方法]以番茄品种渝粉109为试验材料,在建立番茄植株高效离体再生体系的基础上,以带绿芽生长点的子叶愈伤组织为诱导材料,利用秋水仙素分别采用混培法和浸渍法进行番茄同源四倍体的离体诱导。[结果]以带绿芽生长点的子叶愈伤组织为诱导材料,番茄同源四倍体离体诱导采用混培法,0.2%的秋水仙素处理48 h时获得了最高诱导率,为50.0%;浸渍法虽然诱导率较高,但对外植体的药害程度大。[结论]通过混培法获得了较高的诱导率,为番茄品种改良和种质资源的创新与丰富提供了一条新的途径。     

棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析

【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉（Gossypium barbadense L.）GbU6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中（花粉）高效转录的GbU6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的GbU6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer 5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整GbU6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将GbU6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个GbU6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以pBI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个GbU6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种GbU6::GUS的表达载体。将含有CaMV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种GbU6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的GbU6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种GbU6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个GbU6启动子序列进行序列比对,结果表明,GbU6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用GbU6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个GbU6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中GbU6-5P::GUS的染色相对较深,接近于CaMV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的GbU6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。