种子特异启动子的DGAT基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica,napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因片段,并将它们依次插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,PCR检测结果证明,重组质粒p1390ND已成功导入农杆菌细胞.该载体可应用于油料能源植物种子含油最的遗传改良.     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

大豆种子特异性启动子的分离及结构分析

 采用PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP666）。序列比较和分析表明，这一启动子片段与其它两个大豆种子特异性启动子--β-伴球蛋白α′-亚基基因启动子片段和β-伴球蛋白β-亚基基因启动子--片段在序列结构上有很大的相似性，并具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件，据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。Δ6-脂肪酸脱氢酶是亚油酸脱氢形成γ-亚麻酸的限速酶。将启动子片段BCSP666与深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）连接，构建种子特异性表达载体pBMI666。通过农杆菌介导法转化大豆子叶节，在转基因愈伤组织中表达了脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）,获得γ-亚麻酸，初步验证了启动子片段BCSP666的启动子活性。     

油菜油体蛋白基因启动子的克隆及在油葵中的功能验证

利用PCR技术,从油菜(Brassica campestris)基因组DNA中克隆20 ku油体蛋白基因上游903 bp的调控序列NOP,将其与GUS基因融合构建植物表达载体,利用花粉管通道法转化油葵并进行PCR扩增,组织化学染色检测启动子和GUS基因在油葵基因组中的整合和表达情况。结果表明,NOP序列1~903 bp与报道序列同源性为95%,包含驱动基因表达的重要元件及驱动基因在种子中特异表达所必需的核苷酸序列;目的片段已整合到油葵基因组中,NOP具有种子特异性启动子的功能,能够驱动GUS基因在油葵种子中特异性表达,而在油葵根、茎、叶中均不表达。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

GlgC基因种子特异过表达载体的构建及对甘蓝型油菜的转化

【目的】通过表达外源GlgC基因增加甘蓝型油菜种子淀粉积累,从而可能增加含油量,为油菜高含油量育种提供一种潜在的新途径。【方法】本研究将定点突变的大肠杆菌AGPase基因GlgC分别和2个种子特异表达启动子DOF(拟南芥球形胚阶段启动子)、Cruc(油菜种子特异蛋白启动子)重组,构建2个GlgC过表达载体pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。【结果】PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,GlgC基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。【结论】获得了甘蓝型油菜转GlgC基因阳性株,为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。     

未知功能基因BnaC03g45680D的克隆和植物表达载体的构建

为探明基因BnaC03g45680D的生物学功能,以甘蓝型油菜(鼎油杂4号)为试验材料,采用RT-PCR技术并进一步利用农杆菌介导法转化植物进行研究。结果表明:甘蓝型油菜叶片RNA扩增出介于678bp的基因片段,其与Genbank报道的甘蓝型油菜基因BnaC03g45680D预测序列的同源性为100%;构建了含有2×CaMV35S启动子的植物表达载体PCAMBIA1300S-BnaC03g45680D。     

转基因油菜 W-4 fad_2基因沉默的种子特异性分析（英文）

目的]研究转基因油菜W-4的种子fad2基因受RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。[结果]对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸脱饱和指数(ODP)平均为0.07较Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰（RNAi）载体,通过设计引物克隆了 PK基因长498 bp的 siRNA靶序列,连接到 pEASY-T1载体上,采用 NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的 RNAi 平台载体 pHurricane 的 NotI 和XhoI位点,通过多重 PCR 鉴定证实载体构建成功,然后将上述 PK基因反向重复框克隆到加入 napin启动子的 pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究 PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建(英文)

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的RNAi平台载体pHurricane的NotI和XhoI位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

转基因油菜 W-4 fad2基因沉默的种子特异性分析

目的：]研究转基因油菜 W鄄4的种子fad2基因受 RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量 PCR法分析比较了转基因油菜 W鄄4与非转基因对照 Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的 fad2基因的相对表达量。[结果]对照 Westsr种子中 fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W鄄4种子中 fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照 westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜 W鄄4在种子发育过程中表达的 fad2基因的 dsRNA干扰了 fad2基因表达。W鄄4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示：W鄄4种子中油酸脱饱和指数（ODP）平均为0.07较 Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜 fad2基因表达下降的时期与 napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中 RNAi干扰 fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受 napin启动子的准确控制。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

水稻花药特异表达基因RA8的启动子的分离和结构分析

根据文献设计一对引物 ,通过PCR的方法扩增了RA8是水稻花药特异表达基因的启动子。序列分析表明该启动子含有CAATbox的序列CAAT、TATAbox的序列TATAATA等表达调控元件 ,以及编码区的起始密码子ATG。     

番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论克隆获得了番茄LeGRP2基因启动子,该启动子主要在转基因拟南芥根部表达GUS基因,具有较强的根表达特异性。     

棉花种子特异性启动子的克隆及序列分析

启动子是基因表达的重要顺式调控元件,在基因工程中,种子特异性启动子可以调控外源基因在种子中特异表达,提高表达效率,增强转基因的效果。本试验根据棉花LEA蛋白D34基因序列设计引物,以海岛棉基因组DNA为模板,通过touch down PCR技术,获得D34基因的种子特异性启动子片段。测序结果表明该片段长1 384 bp,与已发表的D34基因序列相似度为94.87%。该片段除了含有启动子的基本元件TATA框、CAAT框外,还含有种子特异性启动子元件E-box、G-box、B-box、AACA基序等。此外,对其顺式元件做了生物学功能分析。     

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。