转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

转录因子BvM14-Dof3.4响应盐胁迫的功能研究

Dof(DNA binding with one finger)家族转录因子是植物特异的转录因子,在胁迫响应、种子发芽、氮同化、光合作用等多种生物学过程中发挥着重要作用。为了探究转录因子BvM14-Dof3.4在响应盐胁迫过程中的生物学功能,本研究以具有强耐盐特性的甜菜M14品系为试验材料,用花序浸染法将BvM14-Dof3.4基因在野生型拟南芥植株中异源表达,经150 mmol/L NaCl处理后发现,BvM14-Dof3.4基因的异源表达促进了盐胁迫下转基因拟南芥植株根的生长,提高了异源表达植株的鲜重和干重,与野生型拟南芥相比异源表达植株中K⁺/Na⁺比值增加1.3倍、甜菜碱含量增加1.1倍以及SOD和POD的酶活性分别上调1.3和1.2倍,从而减少了盐胁迫对异源表达拟南芥植株的损伤。这些结果表明了BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫,并且BvM14-Dof3.4基因的异源表达能够提高拟南芥植株的耐盐能力,该结果对甜菜M14品系优质基因资源的挖掘以及开展栽培甜菜抗逆性的遗传改良工作具有重要意义。     

甘蓝型油菜BnADH3基因的克隆及转BnADH3拟南芥的耐淹性

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜耐淹品系WR-4中克隆获得Bn ADH3基因,其完整开放阅读框为1137 bp。该基因编码379个氨基酸,与甘蓝Bo ADH3基因和拟南芥At ADH3基因高度同源,同源性分别达到96%和91%。利用定量RT-PCR检测Bn ADH3基因在油菜耐淹系WR-4和不耐淹系WR-24中的表达表明,在淹水处理下该基因表达受到一定的诱导,淹水处理6 h后表达开始上调,说明Bn ADH3基因在油菜耐淹机制中发挥作用;将其转化到模式生物拟南芥中,采用幼苗淹水3 d后去水处理,测定表明转基因株系叶片和根系中乙醇脱氢酶活性均高于野生型;生长4周和6周的拟南芥植株淹水3 d后的表型显示,Bn ADH3的表达可增强拟南芥对淹水胁迫的耐性,处理的T2代转基因幼苗大部分恢复,但野生型幼苗枯死;调查表明,淹水5 d后野生型植株的存活率为26.7%,转基因株系ADH33和ADH44的存活率分别为80.0%和66.7%。     

转betA基因增强小麦的干热风抗性

甜菜碱是细胞内重要的渗透调节物质,其积累能有效提高植物对非生物逆境的抗性。以转betA基因小麦和未转基因的野生型为材料,在灌浆期模拟干热风胁迫处理植株3 d,研究干热风对植株生长和籽粒产量的影响。胁迫处理后,转基因植株保持较好长势,叶片青枯失水较少,旗叶持绿面积显著大于野生型。各株系植株的光合作用能力和蔗糖磷酸合成酶(SPS)及蔗糖合成酶(SS)活性在胁迫处理后都下降,转基因植株的净光合速率下降到2.3~3.7 μmol CO₂ m^-2 s^-1,而野生型下降到1.2 μmol CO₂ m^-2 s^-1;野生型植株的SPS和SS活性的下降幅度分别为处理前56.8%和53.9%, 而转基因株系的下降幅度分别为62.3%~69.8%和56.5%~64.5%。干热风胁迫使得各株系植株的旗叶甜菜碱含量升高,但转基因株系的叶片甜菜碱含量比野生型的高18%~87%。在甜菜碱保护作用下,转基因植株在胁迫条件下能够维持较高的光合速率,合成较多的碳水化合物,使得百粒重和单株产量均高于野生型。因此,通过转betA基因可显著提高小麦在干热风处理条件下的甜菜碱含量从而增强其抗干热风能力。     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。     

转GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性

以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号为试验材料,克隆到1个A亚族bZIP类转录因子基因,命名为GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein)。该基因由1 317个核苷酸组成,编码439个氨基酸残基,包括4个保守的磷酸化位点区域(C1、C2、C3和C4)、1个核定位信号区(KVVE)和1个bZIP转录因子保守域。聚类分析显示GmAREB蛋白与拟南芥ABF2、水稻OsTRAB1具有较高的同源性,并存在较近的亲缘关系。采用凝胶阻滞实验方法证明GmAREB蛋白与ABRE顺式元件具有体外结合特异性。功能分析结果表明, 在干旱胁迫条件下, GmAREB转基因拟南芥的存活率(50%)显著高于野生型(5%);气孔统计分析显示转基因植株的气孔开度(0.8 μm)明显比对照开度小(2.6 μm)。氧化胁迫结果显示GmAREB转基因拟南芥在甲基紫精溶液中叶绿素含量比野生型高(7.3 mg g^–1 FW)。转基因拟南芥RT-PCR分析表明,GmAREB基因过表达能够增强下游胁迫相关基因ABI1、ABI2的表达,抑制气孔开闭相关基因KAT1、KAT2的表达。综上所述,GmAREB基因过表达有效调控了转基因拟南芥下游靶基因表达,加速了气孔关闭,减少了水分蒸发和叶绿素降解,从而提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫耐性。     

异源表达棉花GhPAO3基因对拟南芥种子萌发的影响

本研究以野生型WT(Wild Type)和转GhPAO3基因拟南芥种子为材料,研究NaCl和外源多胺及多胺抑制剂对WT和转基因拟南芥种子萌发的影响。结果表明,随着NaCl浓度的提高,对拟南芥种子萌发表现出较明显的抑制作用,150 mmol/L、200 mmol/L NaCl处理下造成种子萌发分别推迟1 d和2 d,且转基因拟南芥发芽率低于野生型,表明GhPAO3基因过表达可能对NaCl处理下拟南芥种子的萌发有抑制作用。此外,在100 mmol/L NaCl处理条件下,WT在第3天出现子叶变绿,而转基因植株在第4天出现子叶变绿,转基因拟南芥子叶变绿的数量低于WT;在此基础上添加外源多胺显示,添加Put时,与对照(ck)相比,WT和转基因株系的子叶变绿的数量均有所提高,且转基因株系子叶变绿提前,而添加Spd和Spm时,WT和转基因株系子叶变绿均推迟1 d。所有处理下转基因拟南芥的子叶变绿的数量低于WT,推测NaCl处理和过表达株系产生的H₂O₂抑制拟南芥的子叶变绿。外源多胺和多胺抑制剂处理结果显示,外源多胺和PAO抑制剂(1,8-DO)能够促进拟...     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶提高植物抗逆性功能分析

为研究甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的功能,本研究采用叶盘法将M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因转化烟草,获得T1代转基因植株,而后以野生型及转空载体植株为对照,分别在对照、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘露醇及200 mmol/L甘露醇的培养条件下进行植株生理指标的抗逆性分析。研究发现在100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,转基因植株的鲜重、木质素含量以及叶绿素含量均显著高于对照植株。此外,研究结果表明转基因植株在100 mmol/L甘露醇胁迫条件下根长和叶绿素含量显著高于对照植株,如转基因植株的根长和叶绿素含量分别为0.68 cm和 0.31 mg,而野生型植株的根长和叶绿素含量分别为0.51 cm 和0.18 mg。研究结果表明转M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因烟草植株对盐和干旱胁迫具有较强抗性,这为进一步深入研究M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能奠定重要基础。     

盐胁迫下棉花基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析

盐胁迫是非生物逆境中对作物危害比较严重的自然灾害之一, 严重影响和制约作物的产量和种植面积。本研究以陆地棉品系YZ1为材料, 调查不同NaCl浓度下棉花幼苗生长及根基因组DNA的甲基化水平和变化模式。结果表明,对棉花幼苗的株高和根长生长100 mmol L^-1 NaCl有促进作用, 200 mmol L^-1 NaCl有显著抑制作用;100~200 mmol L^-1 NaCl胁迫严重抑制棉花幼苗的侧根数量。甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明, 经100、150和200 mmol L^-1 NaCl处理后根基因组DNA甲基化比率分别为38.1%、35.2和34.5%, 均低于对照(41.2%), 同时棉花幼苗根DNA的甲基化水平与NaCl处理浓度呈显著负相关(r = –0.986)。与对照相比, 100、150和200 mmol L^-1 NaCl胁迫下棉花幼苗根基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为6.4%、7.6%、11.3%和12.7%、11.1%、8.2%。此外, 序列和RT-PCR分析表明, 与MSAP差异片段高度同源的基因的表达在处理与对照间差异显著。     

利用子房滴注法获得转高亲和性钾离子转运蛋白基因(AlHAK1)棉花植株

棉花植株再生困难、基因型依赖性强和转化周期长等因素一直制约着棉花遗传转化的发展。本研究利用1种不依赖组织培养的转化方法 ,即子房滴注转化方法将獐茅高亲和性钾离子转运蛋白基因(Al HAK1)导入棉花基因组中。结果表明在1006株转化幼苗中有44株为卡那抗性植株,其中35株经PCR检测为阳性(T0代),转化率为3.5%。Southern与Northern杂交结果进一步表明外源基因已整合至棉花基因组中并在转录水平上表达。在提供外源0.05 mmol·L-1 K+水平下,T1转基因棉花叶片中K+含量约为对照植株的2倍,在根中约为野生型植株的1.5倍;而在2.5 mmol·L-1 K+的正常水平下,转基因棉花与野生型植株K+含量差异不明显。在50~200 mmol·L-1 Na Cl胁迫条件下,转基因棉花的种子发芽率明显高于野生型植株,尤其是在150mmol·L-1Na Cl胁迫条件下,转基因植株种子的发芽率是野生型的2.8倍左右。本研究为子房滴注转化体系在生产实践中的广泛应用提供了理论依据,并为培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供了新的种质资源。     

Transformation of tobacco with an Arabidopsis thaliana gene involved in trehalose biosynthesis increases tolerance to several abiotic stresses

Summary Trehalose (a non-reducing disaccharide) plays an important role in abiotic stress protection. It has been shown that using trehalose synthesis genes of bacterial origin, drought and salt tolerance could be achieved in several plants. A cassette harboring the AtTPS1 gene under the control of the CaMV35S promoter and the Bialaphos resistance gene was inserted in the binary plasmid vector pGreen0229 and used for Agrobacterium-mediated transformation of tobacco (Nicotiana tabacum). T0 plants obtained were analyzed by PCR for the presence of AtTPS1 gene. Thirty lines were positive and seeds were germinated on media with 6 mg/l PPT to obtain T1 plants that were grown in the greenhouse to obtain T2 seeds that were germinated on selective media. Lines which seeds showed a 100 % survival rate were considered homozygous transgenic T1 lines. Three lines were selected and gene expression confirmed by northern and western blots. Transgenic seeds were germinated on media with different concentrations of mannitol (0, 0.25, 0.5 and 0.75 M) and sodium chloride (0, 0.07, 0.14, 0.2, 0.27 and 0.34 M) to score their tolerance to osmotic stress. Assays were conducted to test the tolerance of transgenic plants to drought (measurement of water percentage as a consequence of water withdrawal), desiccation (measurement of water loss as a consequence leaf detaching) and temperature stresses (germination at 15 ^∘C and 35^∘C). Transgenic tobacco plant lines registered higher germination rates under osmotic and temperature stress situations than did wild-type plants. Responses to drought and desiccation stresses were similar for all plant lines. It can hence be suggested that the heterologous expression of TPS1 gene from Arabidopsis can be used successfully to increase abiotic stress tolerance in model plants and probably in other crops.     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

室外盆栽条件下盐胁迫对甜高粱光系统II活性的影响

室外盆栽条件下, 设置2个NaCl浓度(100 mmol L^–1和200 mmol L^–1), 调查盐胁迫对甜高粱光合特性和光系统II (PSII)活性的影响。结果表明,叶片Na⁺离子含量与Na⁺/K⁺比随盐浓度增加和处理时间延长而增加。净光合速率(P_n)、光系统II开放反应中心天线转化效率(F_v¢/F_m¢)、光化学猝灭系数(q_P)和光系统II实际光化学效率(Φ_PSII)随盐浓度的增加而降低,非光化学猝灭(NPQ)随盐浓度增加而增加;100 mmol L^–1处理组的P_n、F_v¢/F_m¢、q_P和Φ_PSII随处理时间延长有所恢复,但200 mmol L^–1处理组无此现象。光系统II (PSII)最大光化学效率(F_v/F_m)在100 mmol L^–1 NaCl处理时影响较小,但在200 mmol L^–1 NaCl处理时明显下降。短期盐胁迫未影响荧光诱导动力学曲线,而200 mmol L^–1 NaCl处理5 d后荧光诱导动力学曲线O-K和O-J相上升。进一步研究证明,PSII的失活速率在两个盐浓度下均无明显变化,而修复速率在200 mmol L^–1盐浓度处理5 d后降低明显。因此,认为室外盆栽条件下盐胁迫造成甜高粱碳同化能力降低并改变PSII激发能分配;叶片Na⁺离子含量的大幅增加会导致PSII活性下降及光抑制,这与PSII失活速率无关,主要是失活PSII修复速率受抑制的结果。这对理解户外盐胁迫条件下C₄作物的光抑制机制具有一定意义。     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。     

转GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析

从野生大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选并克隆到GsCBRLK基因, 与人工合成的高甲硫氨酸含量SCMRP基因构建成双价植物表达载体, 将其转入苜蓿, 获得超量表达的转基因苜蓿, 并进行耐碱性分析。结果显示, 经过100、150 mmol L^–1 NaHCO₃处理14 d后, 转基因株系生长状态良好, 而非转基因对照株系萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05), 而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P<0.05), 说明超量表达GsCBRLK基因增强了苜蓿的耐碱能力;各转基因株系的甲硫氨酸含量均比对照植株高, 表明SCMRP基因的导入提高了苜蓿叶片甲硫氨酸的含量。