RT-PCR和实时荧光RT-PCR一步法检测大豆中菜豆荚斑驳病毒

针对进口大豆的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)检测,建立了一步法RT-PCR和一步法实时荧光RT-PCR检测方法.依据BPMV的外壳蛋白编码基因设计了特异引物和特异Taqman探针,特异引物的扩增片段约为500bp,阳性质粒的实时荧光PCR方法的检测下限为20fg/μL,是一步法RT-PCR方法的100倍,检测时间由约8 h缩短至4 h.种脐灰色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阳性,种脐黑色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阴性.     

应用细菌磁颗粒实时荧光RT-PCR检测南瓜花叶病毒

 A novel real-time RT-PCR method, BMPs based real-time RT-PCR which integrated with magne-tic separation technique of bacterial magnetic particles(BMPs), was set up for detection of Squash mosaic virus(SqMV).After SqMV particles in crude sap were concentrated by BMPs, viral RNAs were released and detected by real time RT-PCR.The results indicated that BMPs based real-time RT-PCR was efficient, and the detection sensibility was equivalent to that of the Trizol based real-time RT-PCR, of which Trizol reagent was used for viral RNAs extration.Comparing to Trizol-based method, the BMPs-based method had advantages of simplicity on operation, time saving for RNA extraction and without using noxious organic chemicals.     

玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国对外公布的检疫性有害生物。本研究根据该病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计得到特异性引物及Taqman荧光探针,建立了MCMV的实时荧光RT-PCR方法,并对其灵敏度与特异性进行了研究。该方法针对2个不同来源的毒株均能得到典型扩增曲线,而没有从小麦线条花叶病毒、玉米粗缩病毒和玉米矮花叶病毒的RNA得到扩增曲线,表明引物与荧光探针具有良好的特异性。针对玉米褪绿斑驳病毒RNA不同稀释度样品,实时荧光RT-PCR检测低限达到10-5稀释度,检测灵敏度要比普通RT-PCR高出100倍。因此,本研究建立的MCMV实时荧光方法具有特异性强、灵敏度高和快速有效的优点。     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。     

一种快速检测菜豆荚斑驳病毒的新方法

菜豆荚斑驳病毒是危害大豆等豆科植物的重要病毒,在美国已引起大豆产量的巨大损失,我国尚无此病毒分布。但随着我国进口大豆数量不断增加,该病毒随大豆传入的风险逐步增大,为保护我国大豆产业的安全,迫切需要建立一套准确快速的检测方法。目前对植物病毒的检测主要通过血清学和分子生物学等方法。血清学方法有特异性强、结果易观察等优点,但步骤繁琐。     

应用TaqMan MGB探针技术检测菜豆荚斑驳病毒

根据菜豆荚宽驳病毒(Beanpod mottle virus,BPMV)不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了BPMV的实时荧光RT-PCR检测方法.该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高了100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适于对BPMV的快速检测.应用该方法,对来自美国不同地区的携带有BPMV的大豆样品进行检测,均能够得到BPMV的典型扩增曲线,表明引物与探针对BPMV不同分离株具有良好的简并性.     

应用细菌磁颗粒RT-PCR检测3种植物病毒

根据细菌磁颗粒对植物病毒颗粒的非特异性吸附作用,建立了一种新的提取植物病毒RNA的方法。利用细菌磁颗粒收集黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和百合无症病毒等3种病毒颗粒,富集分离后,通过高温使其裂解释放出病毒RNA,进行RT-PCR检测。与利用Trizol试剂提取这3种植物病毒的RNA相比,具有操作简单、无毒性,能够显著缩短提取时间。对黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测灵敏度验证表明:BMPs-RT-PCR与Trizol-RT-PCR的检测灵敏度相同,均为105倍的植物叶片组织稀释液。     

应用细菌磁颗粒real-time RT-PCR检测百合无症病毒

为研究细菌磁颗粒分离提取不同样本材料中的植物病毒RNA的效果,以及结合实时荧光 RT-PCR技术检测LSV的灵敏性,选取感染病毒的西葫芦叶片（CGMMV和SqMV）、大豆种子（BPMV）与百合叶片（LSV和ArMV）3种样本材料,利用细菌磁颗粒分别提取这5种病毒RNA,与Trizol方法提取效果进行比较,同时与Trizol real-time RT-PCR检测LSV的灵敏度进行了比较。结果表明：BMPs方法能够从3种植物样本中提取病毒RNA,其检测LSV的灵敏性与Trizol方法相当。     

菜豆种子中菜豆普通花叶病毒的RT-PCR检测

为研究国家作物种质库中保存菜豆种质携带种传菜豆普通花叶病毒（BCMV）的状况，根据BCMV的印基因序列设计一对特异性引物，从BCMV侵染的菜豆叶片上扩增出与理论大小一致的714bp的片段。在此基础上，应用改进CTAB法从菜豆干种子中提取总RNA并特异性扩增出相同大小的片段。对目的片段进行克隆、测序和序列同源性比较，结果表明，扩增片段的序列与其它BcMV的印基因序列同源性达88％-98％，确证该方法可以从莱豆干种子申直接检测BCMV。利用建立的方法，分别从单粒菜豆种子样本和30粒菜豆种子样本中检测到BCMV，其检测灵敏度较ELISA方法更高。来自河北的紫芸豆单粒种子带毒率高达100％，而在不同地理来源的6份菜豆种质中，4份被检出携带BCMV，表明入库保存的菜豆种质和种子已普遍为BCMV所侵染。     

温州蜜柑萎缩病毒实时荧光RT-PCR检测

温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)属于温州蜜柑萎缩病毒属Sadwavirus,其寄主范围广,可侵染几乎所有的柑桔属及其近缘属的植物。感染SDV的柑桔树矮化,叶片为典型的船形或匙形叶,并造成果实品质和产量下降。SDV引起的温州蜜柑萎缩病最初在日本流行,20世纪80年代随引种传入我国,且随着一些优良品种的推广而逐步扩散。目前对温州蜜柑萎缩病尚无有效     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

一种高效的苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法

为建立一种检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ACLSV外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和Taq Man探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为阳性标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为100拷贝/μL,比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于0.84%。表明Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。     

实时荧光RT-PCR一步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒（Southem bean mosaic virus，SBMV）是我国二类检疫性有害生物，以南方菜豆花叶病毒日本分离物（SBMV-J）总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18．T载体上。序列分析结果表明：SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成，编码266个氨基酸，SBMV．J与其它分离物及株系印基因的核苷酸序列同源性为83％-97％，氨基酸序列同源性为86％-97％。由于SBMV各分离物及株系印基因的同源性较低，难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术，建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16pg，最佳检测总RNA的量是0．16ng。