大珠母贝人工苗水泥池中间培育技术研究

[目的]研究大珠母贝贝苗的池塘中闻培育技术。[方法]分3批提供贝苗3万、43万和15万粒（2．0—3．0mm）开展水泥池塘（335m^2）吊养,贝笼选用20、40和80目的用不锈钢和聚乙烯网片制作的圆形笼,先用网目密的贝苗笼,随着贝苗的生长逐渐换用网眼大的笼。一般日换水量在10％-30％,控制水透明度在60-80cm,水温不超过33℃。按比例投放饵料,定期泼洒营养盐,约5d追肥1次。[结果]3枇人工繁殖的贝苗,经4个月的水泥池养殖,平均壳长分别增长至35．8、27．7和23．4mm,平均壳高分别增长至30．1、24．9和20．1mm,成活率分别为29．5％、17．4％和17．9％。[结论]大珠母贝种苗池塘中间培育生长速度快,成活率高,有望克服海区养殖的大规模死亡问题。     

大珠母贝海区不同深度养殖试验

采用下潜式缆绳吊养大珠母贝幼苗,设计5个不同的水深,记录养殖海区的水文因子,测量大珠母贝的壳长和壳高两个性状指标,统计成活数,比较不同水层贝苗的生长情况和存活率.结果表明,大珠母贝在4、5、6m水层生长较快,3个深度下幼苗的生长差异不显著;2m和3m水深的贝生长速度较慢,其中3 m水层的壳长与4、5、6m的差异显著.大珠母贝在5 m的深度条件下养殖幼苗存活率最高,4m水层次之,而在2m水深下幼苗的成活率最低(52％).综合生长和成活数据可知,大珠母贝苗在4～5 m养殖较合适.     

大珠母贝人工苗工厂化标粗试验

大珠母贝人工苗工厂化分组标粗；室内养殖５４ｄ，贝苗平均壳高从地６．６１ｍｍ，增长至１３．０８ｍ，最大为１４．８５ｍｍ平均成活率３１．９％，最高达４９．８％。试验初步表明，大珠母贝岸上室内工厂化养殖不但可行，而且也将解决当前海上养成困的一条出路；２．发现自然涨区中也存在饥饿死亡现象及死亡潜伏期，反映出海上养殖高死亡率的复杂性；３；人工配合饲料的应用显著提高了贝苗的增长率和成活率，显示出广阔的商业价值     

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框（ORF）1026 bp,5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp,3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点（pI）为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P.fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas,XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians,ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata,AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）,其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

4 种消毒剂对大珠母贝幼贝的急性毒性试验…

研究了戊二醛、二溴海因、蛋氨酸碘和次氯酸钙等4种消毒剂对大珠母贝(Pinctada maxima)幼贝的急性毒性,结果表明,毒性大小依次为次氯酸钙二溴海因蛋氨酸碘戊二醛,24 h半致死质量浓度(LC50)分别为13.05、27.49、53.20、67.36 mg/L,48 h LC50分别为10.15、9.35、29.27、35.58 mg/L,安全浓度SC分别为1.86、0.32、2.66、7.52 mg/L。分析认为,由于戊二醛毒性相对较小,且在其安全浓度以下可获得较好的消毒效果,因此在大珠母贝幼贝的养殖过程中,推荐使用戊二醛作为常用消毒剂,二溴海因和蛋氨酸碘应谨慎使用,次氯酸钙不推荐使用。     

盐度和饵料种类及浓度对大珠母贝稚贝滤水率的影响

采用静水清滤法对大珠母贝稚贝的滤水率进行研究。在自然海水盐度(33‰)、水温28℃条件下,不同金藻浓度(0.5×105、1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105个/mL)的滤水率随藻浓度增加先升后降,当浓度为1.5×105个/mL时滤水率达到最大(0.069 L/h),且满足幂函数关系y=0.0098x0.7097(r=0.9935)。盐度为30‰时,分别投喂金藻(1.5×105个/mL)和扁藻(0.8×105个/mL),结果表明,在前2 h内稚贝对金藻的滤水率大于扁藻,3 h时稚贝对金藻和扁藻的滤水率相近,3 h后稚贝对扁藻的滤水率大于金藻。不同盐度(24‰、27‰、30‰、33‰、36‰)下,稚贝对扁藻(0.8×105个/mL)的滤水率随盐度的增加先升后降,当盐度为30‰时滤水率达到最大(0.0636 L/h)。     

大珠母贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析及应激表达研究

通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了大珠母贝(Pinctada maxima)组织蛋白酶D基因(命名为pmCTSD)的cDNA全长序列1 742 bp,其中5'非翻译区(UTR)38 bp,3'UTR 534 bp,开放阅读框1 170 bp,编码390个氨基酸,分子量约为41.9 ku,等电...     

野生大珠母贝形态性状对湿重和壳重的相关性及通径分析

[目的]确定野生大珠母贝形态性状对湿重和壳重的直接或间接作用及其决定系数,为人工选育目标性状提供最佳的测量指标.[方法]以在海南三亚市西岛附近海域捕捞的157只贝龄超过2龄的野生大珠母贝为研究对象,对其形态性状[壳长(x1)、壳高(x2)、壳宽(x3)、绞合线长(x4)]及湿重(y1)和壳重(y2)进行测量后,采用多元回归分析确定形态性状与湿重和壳重间的相关性,通过相关性和通径分析获取影响湿重和壳重的主要形态性状,并建立最优回归方程.[结果]大珠母贝各性状指标的变异系数范围为8.29%~41.80%,且各性状指标间的相关性均达极显著水平(P<0.01).通径分析结果表明,对湿重和壳重直接影响作用最大的形态性状分别是壳高(0.468)和壳宽(0.573),其中,壳高对湿重的决定系数为0.219,壳宽对壳重的决定系数为0.381;对湿重和壳重间接决定作用最大的均为壳高通过壳宽,对应的决定系数分别为0.285和0.381.剔除对湿重和壳重不显著的形态性状后,分别构建大珠母贝形态性状与湿重和壳重间的回归方程,对湿重的回归方程为y1=3.245x1+7.747x2+23.521x3-2383.820(R2=0.897),对壳重的回归方程为y2=4.888x2+27.089x3-1531.922(R2=0.858).[结论]在大珠母贝的选育过程中,当以湿重为选育目标时应以壳高为直接选择,同时加强对壳宽的协同选择;而在以壳重为选育目标时应以壳宽为直接选择,同时加强对壳长的协同选择.     

大规格鳜鱼种苗培育试验

以鲜活鱼为饵料,分两阶段进行了大规格鳜鱼(Siniperca chuatsi Basilewsky)种苗的分级培育试验。第一阶段(鳜鱼种苗全长0.6～1.5 cm)以人工繁育的团头鲂水花为饵料,进行水泥池鳜鱼种苗一级培育,设置4 000、5 000、6 000尾/m2 3个密度梯度;第二阶段(鳜鱼种苗全长1.5～5.0 cm)以配套培育的麦鲮为饵料,进行池塘鳜鱼种苗二级培育,设置60、75、90尾/m2 3个密度梯度。结果表明,第一阶段以5 000尾/m2密度组的生长快、存活率较高(86.67%)、规格整齐,饵料鱼规格为0.3～1.0 cm;第二阶段以75尾/m2密度组的生长快、存活率较高(80.67%)、规格差异小,饵料鱼规格为1.0～3.5 cm。因此,利用水泥池和池塘分级培育大规格鳜鱼种苗可有效解决鳜鱼种苗规模化培育的瓶颈。     

合浦珠母贝三亚养殖群体生长性状的相关与通径分析

随机测定200个2龄合浦珠母贝三亚养殖群体的壳长(X1)、壳高(X2)、壳宽(X3)、顶点-腹缘长(X4)、韧带槽长(X5)、韧带槽宽(X6)和体重(Y)7个性状指标,计算性状间的相关系数。采用通径分析方法计算以形态性状为自变量对体重作依变量的通径系数、决定系数及相关指数,进行各形态性状对体重影响大小的剖分。结果表明,合浦珠母贝除韧带槽宽外,其他性状之间的相关关系都达到极显著水平(P<0.01),体重与壳长的相关系数最大(0.9228)。壳长对体重的直接影响最大(0.5083),是影响体重的主要因素;壳宽与体重、壳高与体重的相关程度很大,但对体重的直接影响均较小,两者主要通过壳长间接影响体重,壳宽、壳高是影响体重的次要因素。决定系数分析结果与通径分析结果有一致的变化趋势。所选贝壳性状与体重的复相关指数为R2=0.8977;多元回归分析建立了壳长、壳高、壳宽估计体重的回归方程为:Y=0.6873X1+0.3182X2+0.9379X3-43.2267。本研究结果为合浦珠母贝育种过程中测量性状的选择提供了理论依据。     

合浦珠母贝不同壳基质蛋白基因的表达水平比较

采用荧光定量PCR 技术分析了不同壳基质蛋白基因之间的表达水平差异,组织表达特征以及育珠对表达水平的影响。结果显示,msi31,aspein,msi7 基因只在外套膜组织中表达;nacrein 和n19 基因除在外套膜表达外,在珍珠囊中也有表达;而accbp 在外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺、腮和珍珠囊中都有表达,在外套膜中表达量最高,其次为性腺。accbp、msi31、msi7和nacrein基因在育珠贝和非育珠贝外套膜中的表达水平有显著性差异,aspein与n19 无显著性差异;其中msi31 基因在育珠贝外套膜的表达量上调,accbp尧msi7与nacrein 下调。不论在育珠贝还是非育珠贝的外套膜组织中,msi31的表达水平最高,n19 最低;但在珍珠囊中n19的表达量最高,且远高于在外套膜中的表达水平。     

马氏珠母贝精子质量形态评定中不同染色法染色效果的比较

为筛选出适宜于马氏珠母贝Pinctada martensii精子形态分析的染色方法,采用曙红Y和结晶紫染液对不同方法制作的马氏珠母贝精液抹片进行染色,并通过显微镜观察比较染色效果。结果表明:1)采用将精液先抹片后染色(0.8 mg/mL曙红Y染液)的方法时,精子头部着色不完全,染色效果不随染色时间的延长而改善,精子形态特征不明显,故该方法不适于精子形态检测;2)将精液与20 mg/mL的曙红Y染液等体积混合后抹片,精子头部着深红色,尾部着浅红色,精子各部分结构清晰,形态特征明显,背景干净,对比明显;3)用5 mg/mL的结晶紫染液对精液进行渗透染色时,精子形态染色特征明显,头部着深紫色,尾部着浅紫色,背景干净,可较准确地判断精子的形态特征;4)依精子形态对马氏珠母贝精子进行分类,并确定了主要的畸形类型及其特点,马氏珠母贝精子畸形主要集中在精子的颈部和尾部,头部畸形情况较少;5)采用两种染色方法判定的正常精子率之间无显著差异(P<0.05),数据稳定,因此,这两种染色方法均可用于马氏珠母贝精子形态的评价中。     

马氏珠母贝精子质量形态评定中不同染色法染色效果的比较

为筛选出适宜于马氏珠母贝Pinctada martensii精子形态分析的染色方法,采用曙红Y和结晶紫染液对不同方法制作的马氏珠母贝精液抹片进行染色,并通过显微镜观察比较染色效果。结果表明：1）采用将精液先抹片后染色（0.8 mg/mL曙红Y染液）的方法时,精子头部着色不完全,染色效果不随染色时间的延长而改善,精子形态特征不明显,故该方法不适于精子形态检测;2）将精液与20 mg/mL的曙红Y染液等体积混合后抹片,精子头部着深红色,尾部着浅红色,精子各部分结构清晰,形态特征明显,背景干净,对比明显;3）用5 mg/mL的结晶紫染液对精液进行渗透染色时,精子形态染色特征明显,头部着深紫色,尾部着浅紫色,背景干净,可较准确地判断精子的形态特征;4）依精子形态对马氏珠母贝精子进行分类,并确定了主要的畸形类型及其特点,马氏珠母贝精子畸形主要集中在精子的颈部和尾部,头部畸形情况较少;5）采用两种染色方法判定的正常精子率之间无显著差异（P〈0.05）,数据稳定,因此,这两种染色方法均可用于马氏珠母贝精子形态的评价中。     

2种贝龄合浦珠母贝数量性状的相关与通径分析

[目的]明确不同贝龄合浦珠母贝(Pinctada fucata)壳形态性状(壳高、壳长、壳宽和铰合线长)与产量性状(体质量、软体部质量和壳质量)间的相关性,筛选出对合浦珠母贝产量性状的影响因素及其决定程度,为产量性状的选育提供理论依据.[方法]随机选取形态较完整的1龄合浦珠母贝184只和2龄合浦珠母贝191只,分别测量其壳形态性状[壳高(SH)、壳长(SL)、壳宽(SW)和铰合线长(VL)]及产量性状[体质量(BM)、软体部质量(VM)和壳质量(SM)]后,使用SPSS 24.0进行相关分析和通径分析,并通过线性逐步回归分析建立多元线性回归方程.[结果]1龄合浦珠母贝壳形态性状变异系数在12.19%~15.15%,产量性状变异系数在30.90%~39.27%;2龄合浦珠母贝壳形态性状变异系数在8.90%~10.26%,产量性状变异系数在23.09%~29.23%.2种贝龄合浦珠母贝数量性状间的表型相关性均达极显著水平(P<0.01),各性状间的相关系数范围为0.564~0.955.1龄和2龄合浦珠母贝中进入最终多元回归方程的4个壳形态性状对其体质量的总决定系数(R2)分别为0.864和0.778;对合浦珠母贝体质量直接影响最大的壳形态性状在1龄贝中为壳宽、在2龄贝中为壳高,对应的通径系数分别为0.286和0.536;在壳形态性状对体质量的单独决定作用中,1龄贝以壳宽对其体质量的单独决定作用最大,2龄贝则是壳高对其体质量的决定作用最大,对应的决定系数分别为0.082和0.287.[结论]开展合浦珠母贝人工选育或留种时应根据不同贝龄进行相应性状的挑选,以体质量为选育目标时,在1龄个体中要首先考虑壳宽性状,在2龄个体中则应考虑壳高性状.     

合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析

为丰富合浦珠母贝Pinctada martensii的食品种类,制备出酸甜可口、质量安全的合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片,以合浦珠母贝糖胺聚糖为主料,黏合剂、润滑剂、矫味剂和稀释剂为辅料,采用单因素试验和正交试验方法,确定最佳原辅料配比和最优工艺,原辅料经混合、制软材、干燥、整粒、压片等工序制备出泡腾片,并对制备的泡腾片进行质量指标检测和急性经口毒性试验。结果表明:合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片最优配方为(以质量百分比计)糖胺聚糖25%,崩解剂35%(碳酸氢钠与柠檬酸的配比为1∶2),矫味剂三氯蔗糖3%,黏合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2%,润滑剂聚乙二醇(PEG) 4000 2%,余量为乳糖;按此最优工艺制备的泡腾片直径约为8 mm,重约为200 mg,硬度为5. 5～6. 5 kg,崩解时间<40 s;急性经口毒性试验表明,14 d观察期内SD大鼠均无异常行为及死亡。研究表明,用本研究优化工艺制得的糖胺聚糖片剂产品表面光滑整洁、口感良好,质量安全,稳定可靠,无毒副作用。     

合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因特征与表达分析

研究了合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶(命名为poSe-GPx)基因结构特征和在应激状态下的表达调控机制,其cDNA全长为1271 bp,5′-非编码区(UTR)长28 bp,3′-UTR长631 bp,包括4个RNA不稳定信号结构域(ATTTA)、1个保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和1个位于poly(A)尾巴上游22个核苷酸处的多聚腺苷信号(AATAAA).开放阅读框(ORF)为612 bp,编码由203个氨基酸组成的多肽,分子质量约23.1 ku,理论等电点为8.29.poSe-GPx第51个氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec),由密码子TGA编码.poSe-GPx序列中存在1个保守的GPx签名序列75LGFPCNQF82、1个活性位点序列162WNFEKF167和1个糖基化位点87NCT89.利用MatGAT软件对poSe-GPx氨基酸序列和其他物种GPx序列进行同源性和相似性分析,结果表明:poSe-GPx与其他物种GPx序列具有较高的保守性,同源性为42%-55%,相似性为56%-71%.组织表达模式分析表明:poSe-GPx mRNA在消化腺、鳃、性腺、血细胞、闭壳肌、肠和外套膜中都有表达.免疫应激试验结果显示,在2和4 h时poSe-GPx基因在消化腺中的表达显著上调.