大麦cDNA AFLP技术体系的优化及其应用

为构建适合分析大麦杂种优势的cDNA-AFLP技术体系,以4个大麦不育系、2个大麦恢复系以及按4×2配制的8个杂交种为材料,对影响大麦cDNA-AFLP技术体系的几个关键因素进行了研究。结果表明,大麦cDNA-AFLP技术按以下程序可得到多态性好的清晰条带:使用百泰克公司的TRIpure Reagent总RNA提取试剂可提取到高质量的叶片总RNA;用TaKaRa的M-MLV RTase反转录合成双链cDNA;用MseⅠ和EcoRⅠ酶切6h,再用T4连接酶15℃连接接头18h;预扩PCR反应的dNTP终浓度为0.2mmol.L-1,扩增20循环效果最好;预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增,最终用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离条带。利用该cDNA-AFLP体系对参试杂交种及其亲本的谱带类型进行了分析,亲本与杂种之间共扩增出7种类型的谱带,分别是共同表达型(P1P2F1)、P1表达型(P1)、P2表达型(P2)、F1表达型(F1)、P2F1表达型(P2F1)、P1F1表达型(P1F1)和P1P2表达型(P1P2)。其中差异谱带类型可分为四种表达模式:(1)单亲显性表达型,包括P2F1表达(P2F1)和P1F1表达(P1F1);(2)单亲沉默表达型,包括仅P1表达(P1)和仅P2表达(P2);(3)杂种上调表达型,即仅F1表达(F1);(4)杂种下调表达型,即仅P1P2表达(P1P2)。     

大豆GmPic基因的分离及表达分析

对光敏感型大豆品种“中豆24”进行长日、短日和自然光3种光周期处理,采用cDNA-AFLP的方法筛选差异片段,并进一步通过RACE技术分离了该基因。该基因全长983 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码248个氨基酸,在遗传关系上与线粒体磷酸盐转运蛋白高度同源。通过半定量RT-PCR对该基因在不同光周期中的表达模式进行分析,结果表明,该基因在大豆生长发育的早期阶段表达,短日照抑制其表达,而长日照则增强其表达。因此,大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因可能是作为一种负调控因子参与大豆光周期反应。对大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因的研究能为进一步阐明大豆光周期反应分子机理打下基础。     

利用cDNA阵列初步发掘橡胶树抗寒相关基因

通过橡胶树低温诱导全长c DNA文库,构建了1个含有11 708个Unigene的c DNA阵列。使用这些c DNA阵列对橡胶树抗寒品种93-114和低温敏感种质材料热垦501进行基因表达谱研究。结果表明,在低温诱导情况下,共有84个基因差异表达,其中52个上调表达,32个下调表达。在抗寒品种和低温敏感种质材料间的差异基因有21个,其中在93-114中上调的有12个,下调的有9个。进一步对这些基因进行了功能注释。     

利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

应用cDNA-AFLP技术筛选炭疽菌（Colletotrichum sp.1）危害诱导茶树毛蟹品种（Camellia sinensis cv. Maoxie）的差异表达基因,为探究茶树抗炭疽菌的分子机制奠定基础。利用256对选择性扩增引物组合分析病菌接种后0 h和48 h的叶片cDNA,经筛选、测序和BLAST比对获得136条差异表达片段（TDFs）。同源基因功能分析结果表明,128条TDFs与Nr数据库已有基因同源,其功能以胁迫响应、生物调控与信号转导为主;其中51条TDFs与TPIA数据库中冷害、干旱、盐碱条件下的差异表达基因高度同源。进一步对27条TDFs进行qRT-PCR验证,结果显示,有24条TDFs的表达情况与cDNA-AFLP的结果一致,WRKY转录因子、乙烯响应转录因子、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相关基因的表达显著上调。本试验通过筛选获得差异表达的抗逆相关基因,为后续的基因功能研究奠定基础。     

胡萝卜多糖的提取研究

温水提取胡萝卜多糖,对胡萝卜多糖的提取工艺进行研究。比较料液比、提取时间、提取温度、pH值4个因素对多糖提取率的影响。并采用正交设计法优化提取条件,确定了理论上的最佳提取工艺为A2B2C3D3,即提取温度为60℃、料液比为1:30、提取时间8 h、pH值为11。在此工艺条件提取胡萝卜多糖,其提取率为21.27%。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

茶树紫芽中花青素形成相关基因差异表达分析

花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素,作为一种强自由基清除剂,它具有抗炎,抗氧化,降血压,降血糖等多种保健功能。紫芽茶树作为一种高花青素含量的特异性茶树资源,其研究与利用越来越受人们的关注。为了解茶树紫芽中花青素形成的分子机理,本研究通过对湖南农业大学自选紫芽品种9803与绿芽品种9806进行转录组测序及生物信息学分析,筛选得到42条与花青素代谢相关的unigene,其中比对到参考基因组中的有34条,未在参考基因组中登录的有8条。KEGG富集分析表明这42个基因被富集到5个代谢通路中,包括类黄酮合成途径,木质素合成途径,黄酮和黄酮醇合成途径,油菜素甾醇合成途径,以及参与转录因子的编码。通过荧光定量PCR验证,差异基因荧光定量PCR变化趋势与转录组测序结果一致,转录组测序数据可靠。本次试验在转录组水平上筛选出了茶叶紫芽花青素代谢相关的差异基因,为进一步揭示茶叶紫芽产生的分子机理奠定了基础。     

丛枝菌根真菌与胡萝卜毛状根双重培养体系研究

以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599诱导胡萝卜产生毛状根,接种丛枝菌根（AM）真菌摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）建立双重培养体系,研究不同消毒方法、超声波、低温预处理和培养基pH对摩西斗管囊霉孢子萌发的影响及其与胡萝卜毛状根建立双重培养体系的最佳条件。研究结果表明：消毒方法3孢子萌发率最高,孢子污染率最低,15 d孢子萌发率达48.88%,而污染率仅为9.98%;超声波处理能降低孢子污染率11.17%~14.53%;低温预处理可有效提高孢子的萌发率,4℃低温处理10 d和15 d效果较好,其萌发率分别为70%和65%;AM真菌孢子在水琼脂培养基萌发最佳pH为6.5,萌发率达到48.50%,pH< 5.5或pH>8.0均抑制孢子萌发,pH 5.5和pH 8.0的萌发率分别为15.43%和16.06%。消毒孢子先于水琼脂萌发后,再挑取萌发管多,菌丝较长的孢子并将菌丝生长方向正对毛状根方向进行转接,可以提高双重培养的成功率。MSR培养基为双重培养的最优培养基。胡萝卜毛状根与AM真菌双重培养可为菌根真菌繁殖及相关分子机理研究提供可行有效的途径。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

利用cDNA—AFL吩析辣椒细胞核雄性不育两用系的基因表达差异

[目的]为进一步了解辣椒不育性的分子遗传机理和雄配子的发育机制,对辣椒细胞核雄性不育的育性相关基因进行初步研究。[方法]利用eDNA—AFLP对辣椒细胞核雄性不育两用系‘AB23’的可育株花蕾和不育株花蕾的表达基因进行比较和分析。[结果]可育株与不育株在基因表达上存在差异,筛选出10对引物,并得到了有差异且重复性好且的19条TDFs,其中14条TDFs功能已知,3个功能未知,2个未找到同源序列。该研究通过RT—PCR技术对获得的19个TDFs进行验证,其表达特征与eDNA—AFLP结果一致。[结论]差异基因功能涉及细胞分泌、代谢、转录、细胞程序性死亡、蛋白质修饰、胞间运输、信号转导、细胞黏附等多个相关过程。     

建立番木瓜性别研究的cDNA-AFLP分析体系

以番木瓜幼苗为材料,利用多重PCB技术快速鉴定其性别.建立适合番木瓜性别研究的cDNA-AFLP分析体系,分析影响cDNA-AFLP分析体系的各种可能因素(RNA提取、酶切与连接效率、预扩增效果等),并对影响选择性扩增反应的各因子进行优化.结果表明,选择性扩增的最佳体系,即在反应体系中,各因素终浓度分别为:Ta[酶0.06U/μL;L;Mg2+2.4mmol/L;dNTP 2.0mmol/L;引物0.48 μmol/L.通过优化体系得到的选择性扩增产物,银染检测后条带清晰稳定.表明成功建立了适合番木瓜性别研究的cDNA-AnLP分析体系.     

玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立

以玉米自交系QCL1094为材料,用RNAiso Reagent、柱式试剂盒法、异硫氰酸胍法等3种方法提取苗期叶片总RNA,用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录获得第一链cDNA,用RNase H、E.coli DNA聚合酶I和E.coli DNA连接酶合成第二链cDNA,用T4 DNA聚合酶进行末端平滑得到双链cDNA,最后,用双低频酶EcoR I和Pst I酶切双链cDNA,用T4 DNA连接酶连接接头,用引物EA00和P00进行预扩增,用引物EA01和P01进行选择性扩增。经1%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,RNA提取及cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增的效果良好。     

利用基因芯片筛选甘蔗成熟期叶片差异表达候选基因

利用Agilent甘蔗4×44k（perarray）芯片分析甘蔗叶片在甘蔗成熟期的差异表达基因,并通过生物信息学手段对基因芯片杂交结果进行分析。芯片杂交结果符合质控标准,并且杂交数据重复性良好,结果可靠。在甘蔗生长过程中8个时间点上,共筛选出相关差异在2倍以上的基因20个,其中上调表达基因17个,下调表达基因3个。这些候选基因分别涉及不同水平分子进程和多种代谢途径。     

胡萝卜多糖体外抗氧化活性研究

采用热水浸提法从胡萝卜中提取胡萝卜多糖,通过测定胡萝卜多糖对超氧阴离子自由基(O-2.)、羟基自由基(.OH)、DPPH自由基的清除能力以及对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用,研究其体外抗氧化活性。结果表明,胡萝卜多糖对.OH、O-2.、DPPH自由基具有较强的清除能力,对卵黄脂蛋白脂质过氧化具有一定的抑制作用,因此胡萝卜多糖具有良好的体外抗氧化活性。     

粳稻超亲变异系籽粒谷氨酰胺合成酶基因表达特性及序列变异分析

选用籽粒蛋白质含量有显著差异的亲本和杂种后代超亲变异系,比较分析灌浆过程中籽粒蛋白质积累特性、谷氨酰胺合成酶(GS)活性变化、GS基因mRNA表达量变化和基因碱基序列。结果表明,杂交后代通过籽粒蛋白质含量的连续定向选可获得超亲变异系,籽粒蛋白质积累量与基因型紧密相关;灌浆过程中籽粒GS活性呈单峰曲线变化,籽粒蛋白质含量与籽粒GS活性密切相关,而且籽粒GS活性也能产生超亲变异;在灌浆过程中籽粒蛋白质含量不同的亲本及超亲变异系籽粒GS1.3和GS2基因的mRNA表达量变化趋势基本一致,即随灌浆进程mRNA表达量逐渐增加,到抽穗后15~20d表达量最高,随后逐渐下降,呈单峰曲线变化;GS1.3和GS2基因mRNA表达量与籽粒蛋白质含量关系密切,GS基因mRNA表达量高的基因型籽粒蛋白质含量也高,而且超亲表达;尽管不同品种GS1.3和GS2基因碱基序列保守性很高,但不同品种水稻GS1.3和GS2基因的碱基序列和蛋白质氨基酸序列并不完全一致,存在着个别碱基不同的基因多态性,品种间有性杂交后代在基因分离和稳定过程中通过碱基的替换仍然能发生碱基的随机性变化及三联体密码和氨基酸的变化。     

cDNA-AFLP结合BSA研究马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因差异表达片段

通过对具有 6个无毒基因不同表型的马铃薯晚疫病菌构建的 4个混合池进行cDNA AFLP分析 ,得到与 6个与无毒基因相关的差异表达片段 (TDFs) 85条 ,其中与无毒基因Avr1相关的为 2 0条 ,Avr2 2 8条 ,Avr3 Avr10 Avr1116条 ,Avr4 2 1条。差异表达片段大小主要分布在 10 0bp和 30 0bp之间 ,最小片段为 6 0bp ,最大片段 4 40bp。差异表达片段的获得将有利我们下一步克隆全长无毒基因和对晚疫病垂直抗性机制的研究