黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布

根据已有的决定黄瓜雌性的ACC合酶基因CS-ACS1G,与黄瓜性型有关的ACC氧化酶基因CS-ACO2、CS-ACO3,与黄瓜雌性相关的乙烯受体基因CS-ETR2和CS-ERS的序列,通过设计特异引物,对不同性型黄瓜品种基因组DNA进行扩增。结果表明,5个基因在本试验所用的不同性型黄瓜品种的基因组中均能被检测到,说明这5个性别决定相关基因在本试验中不具有雌性特异性。通过PCR克隆在全雌性黄瓜品种G5224中获得了长度为1 124 bp的ACC合酶基因序列。BLAST分析表明,本试验所获得的ACC合酶基因序列和Trebitsh公布的CS-ACS1G基因序列的同源程度为99 %,表明PCR扩增产物确实为CS-ACS1G基因。此基因在基因组中表现不具雌性特异性的现象与多数研究者的结论相悖。     

不同基因型黄瓜性别与乙烯释放速率的关系

采用气相色谱法测定全雄株(ffMMaa)、雌雄同株(ffMMAA)、全雌株(FFMMaa、FFMMAA)和两性花株(FFmmAA)不同基因型近等基因系材料间的乙烯释放速率,探讨乙烯与黄瓜性型的关系。结果表明,不同近等基因系乙烯释放速率之间存在显著性差异。全雄株78♂(ffMMaa)的乙烯释放速率较低;雌雄同株406(ffMMAA)四叶一心期的乙烯释放速率大于两叶一心期;含6.33个F基因拷贝数的雌性系10098♀(FFMMaa)与F基因拷贝数为2.15的雌性系WI1983G(FFMMAA)相比,乙烯释放速率较低;雌性系WI1983G(FFMMAA)的乙烯释放速率极显著高于两性花株WI1983H(FFmmAA),两性花株WI1983H又极显著高于雌雄同株WI1983GM(ffMMAA);说明黄瓜性别表型与内源乙烯密切相关。从试验结果推断:雄株(ffMMaa)中乙烯释放速率低可能与A基因失活相关,雌性系(FFMMaa)乙烯释放速率可能受A/a基因的调控,两性花株(FFmmAA)中虽然M基因失活但内源乙烯释放速率并未降低很多,可能F基因产生的内源乙烯没有直接作用到两性花的雄蕊上。     

节瓜ACC合酶基因CqACS的克隆与表达分析

为分析ACC合酶与节瓜雌性之间的关系,以雌性自交系(A36)和普通雌雄同株自交系(SX)为材料,克隆得到节瓜ACC合酶(CqACS)基因,并与葫芦科中已知的ACC合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树;对A36幼苗叶片进行赤霉素(GA_3)处理后用qRT-PCR对CqACS基因进行表达分析,并统计赤霉素处理前后20节内的雌花率。结果表明,CqACS基因在雌性自交系A36中的长度为1?318 bp,普通雌雄同株自交系SX中长度为1?637 bp。经对比分析,SX比A36多了91、97、117 bp 3个片段,除此之外只有2个碱基的差别。同源序列比对发现,A36中的CqACS基因与西瓜中的Cit-ACS1基因同源性最高,为95.31%,与黄瓜中的Cs-ACS1基因同源性为91.13%;SX中的CqACS基因与西瓜中Cit-ACS1基因同源性为78.04%,与黄瓜中的Cs-ACS1基因同源性为76.06%。GA_3处理后,A36的平均雌花节率(20节位内)为45%,而对照为90%;qRT-PCR分析发现,与对照相比,CqACS基因在GA_3处理后的相对表达量显著上调,且在第3次处理后4 h上调最大。     

杧果炭疽病菌内切葡聚糖酶基因CgEg1B克隆与敲除载体构建

为了明确内切葡聚糖酶CgEg1B与杧果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides致病力的关系,本试验以杧果炭疽病菌DNA为模板,利用同源克隆技术扩增CgEg1B,对其序列特征、蛋白保守结构域进行分析,并借助In-Fusion HD Cloning Kit技术进行敲除载体构建。结果表明,该基因DNA和cDNA全长分别为1 077bp、1 020bp,编码区有内含子(57bp)1个,推测编码339个氨基酸,其分子量约为37.13kDa,等电点PI为5.11。与NCBI网站中已公布的基因进行Blastp比对,发现该序列与鳄梨炭疽菌C.gloeosporioides(EQB54542.1)的内切葡聚糖酶基因相似性为99%;该基因的敲除载体pCgEg1BGH-1构建成功。CgEg1B基因具备真菌内切葡聚糖酶基因家族的序列特征,推测CgEg1B基因可能与杧果炭疽病菌的侵入、定殖和致病性有关。     

长果形两性花黄瓜的选育及利用初报

两性花类型黄瓜是用来作为雌型黄瓜制种的有效方法。我们用自己先前育成的‘铁皮青’雌性系与雄花两性花品种‘柠檬’杂交和多次回交,育成了长果形的两性花黄瓜新品系,并证实了它在黄瓜育种上的使用价值。这类长果形两性花黄瓜的长度近20cm,长势强健。以纯合基因型雌性系与之配制的杂交组合,一般植株都是全雌的表型,因而完全适用于三交种的制种要求;而由杂合基因型的雌性系与雄花两性花类型材料所配制的杂交组合,在夏秋栽培条件下,植株会有较多的雄花出现。雌性系×两性花系×普通品种所配制的三交种,果实长度因杂交亲本而异,通常都在25-30cm以上。这样的瓜长基本符合市场的需要。     

甜瓜黄瓜性别决定机制模型

首次提出甜瓜和黄瓜的性别由两组四对具有显隐关系的雌性基因与雄性基因互作控制。4个雌性基因的化学实质均为乙烯生物合成途径中的限速酶ACC合酶,4个雄性基因为赤霉素生物合成途径中的某个限速酶。花芽最终发育成雄花、雌花,还是两性花,取决于赤霉素与乙烯之间量的平衡和作用方式。雄花是赤霉素诱导花药生长抑制子房生长发育的,雌花是乙烯诱导子房生长抑制花药生长发育的,两性花是赤霉素和乙烯同步持续诱导子房和花药共同生长发育的．     

节瓜ACC 合酶基因CqACS 的克隆与表达分析

为分析ACC 合酶与节瓜雌性之间的关系，以雌性自交系（A36）和普通雌雄同株自交系（SX）为材料，克隆得 到节瓜ACC 合酶（CqACS）基因，并与葫芦科中已知的ACC 合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树；对A36 幼苗 叶片进行赤霉素（GA3）处理后用qRT-PCR 对CqACS 基因进行表达分析，并统计赤霉素处理前后20 节内的雌花率。结果 表明，CqACS 基因在雌性自交系A36 中的长度为1 318 bp，普通雌雄同株自交系SX 中长度为1 637 bp。经对比分析，SX 比A36 多了91、97、117 bp 3 个片段，除此之外只有2 个碱基的差别。同源序列比对发现，A36 中的CqACS 基因与西瓜中 的Cit-ACS1 基因同源性最高，为95.31%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为91.13%；SX 中的CqACS 基因与西瓜中Cit- ACS1 基因同源性为78.04%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为76.06%。GA3 处理后，A36 的平均雌花节率（20 节位内） 为45%，而对照为90%；qRT-PCR 分析发现，与对照相比，CqACS 基因在GA3 处理后的相对表达量显著上调，且在第3 次 处理后4 h 上调最大。     

黄瓜MADS-box基因家族生物信息学分析及CsMADS-box AGL62的克隆

分别以全雌系D1104-2-4、强雌系D1158♀-2、雌雄异花同株D0528-2为母本,与1个雌雄异花同株父本D0708-2杂交获得杂种一代,调查开花初期、根瓜期、盛果期3个时期雌性相关农艺性状,筛选出差异显著的组合进行转录组测序分析进而分析黄瓜杂交组合间MADS-box家族的差异基因。结果表明:以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代C15-114在雌花数、雌花节率上均具有超亲优势,3个杂交组合F1均具有早熟的中亲优势。转录组分析结果发现,以全雌系D1104-2-4为母本的杂种一代基因表达情况显著的偏向母本,挑选的37个黄瓜MADS-box家族基因只有6个与母本有表达差异,17个与父本有表达差异。生物信息学分析并命名了1个差异最显著的基因Cs MADS-box AGL62,该基因全长745 bp,编码187个氨基酸,编码的蛋白属于线粒体中不稳定的亲水性跨膜蛋白,NCBI比对结果表明该蛋白是1个转录因子,系统进化分析发现其与甜瓜中AGL62同源性最高,在黄瓜中该蛋白和其他黄瓜AGL62亚型属于同一分支并且属于I型。     

两个新发现的黄瓜性别决定基因遗传规律的研究

 选取黄瓜两个雌雄同株型的强雌性高代自交系材料与普通雌雄同株、两性花株、纯雌株高代自交系材料杂交, 通过对F₁、F₂、BC₁ -1 和BC₁ -2 代性型观察, 统计分析表明: 雌雄同株型的强雌性由1对不完全显性和1对隐性基因控制, 暂定名为Mod-F₁和mod-F₂, 它们是新发现的黄瓜性别表达的两个基因, 能增强黄瓜植株雌性的表达, 与F和M 基因独立遗传。     

6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH) 的克隆与甜瓜属异源四倍体的分子验证

 根据已发表的黄瓜6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase ) 基因6PGDH的cDNA序列(GenBank登录号: EU815934) 设计引物, 扩增了甜瓜属异源四倍体新种及野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的6PGDH基因片段, 测序结果表明3个种的6PGDH基因片段序列表现出高度的一致性,长度均为1 098 bp包含936 bp编码311个氨基酸的阅读框和162 bp的3′非翻译区末端, 片段内无内含子存在。利用DNAMAN软件检测到异源四倍体新种与野生种和栽培黄瓜‘北京截头’氨基酸的差异位点有3个, 碱基差异位点有22个, 差异位点的遗传分布符合孟德尔遗传学定律, 从而在分子水平证实了异源四倍体新种是野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的杂交后代。     

宽皮柑橘单核苷酸多态性的高分辨率熔解曲线分型

 高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting analysis,HRM）可以检测单碱基改变引起的DNA双链熔解温度（T_m）值变化,从而可以对样本在单核苷酸多态性分子标记（Single nucleotide polymor- phism,SNP）上进行基因分型。通过分析NCBI数据库中宽皮柑橘的表达序列标签（Expressed sequence tag,EST）数据鉴别SNP位点,并用小片段扩增法高分辨率熔解曲线分型技术（High resolution melting analysis of small amplicons）分析11个宽皮柑橘（Citrus reticulata）品种以及柳橙（Citrus sinensis Osbeck var.‘Liucheng’）的5个SNP位点的基因型。结果显示,小片段扩增法高分辨率熔解曲线分型可以快速、清楚地分辨纯合与杂合基因型,在校正温度差异后也可以很好地分辨同一个SNP位点不同的纯合型。统计分析表明样本在所有SNP位点上均存在多态性,5个SNP位点的平均多态性信息含量（PIC）为0.3190,显示样本在这组SNP位点上具有较高的杂合率。     

甜瓜果实颜色3 个质量性状基因的定位

 以甜瓜（Cucumis melo L.）黄绿皮、白肉、无覆纹的自交系‘K1-7’为母本,黄皮、橘红肉、 无覆纹的自交系‘K3-92-1’为父本杂交,组建F2 遗传群体,采用MSG（multiplexed shotgun genotyping） 法对F2 群体进行基因分型,并在甜瓜全基因组范围内扫描SNP 遗传标记。利用检测到的44 722 个SNP 标记位点进行高密度Bin 遗传图谱的构建,并对甜瓜果皮底色、覆纹颜色和果肉颜色等3 个质量性状进行 遗传分析和基因定位。结果表明,果皮底色和果肉颜色由单基因控制,黄绿果皮和橘红色果肉为显性性 状,果皮底色基因定位在4 号染色体409 828 ~ 835 625 bp 区间内,长度约为425 kb,果肉颜色基因定位 在9 号染色体20 433 942 ~ 20 573 889 bp 区间内,长度约为139 kb,覆纹颜色由两个有上位效应的基因控 制,其中1 个基因位点与果皮颜色控制位点在同一区域,1 个基因定位在2 号染色体末端23 736 803 ~ 23 787 235 bp 区间内,长度约为51 kb。     

甜樱桃‘拉宾斯’自交亲和性与SFB4′基因的关系研究

甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。     

茶树TIDH 核苷酸多样性及与咖啡碱含量的关联分析

 咖啡碱是嘌呤碱中最重要的一种,对茶叶的滋味等品质起重要的作用,对于咖啡碱代谢途 径的研究有重要意义。根据NCBI 登录的TIDH 基因（编码咖啡碱合成途径的一个关键酶--次黄嘌呤核 苷酸脱氢酶）cDNA 设计引物,克隆获得了一条基因组DNA 的中间片段,长4 172 bp（TIDH3）。从中国 茶树资源核心种质中选取咖啡碱含量有代表性的95 份资源进行了两个年度、春秋两季的咖啡碱含量HPLC 测定,大部分材料的咖啡碱含量在2.50% ~ 4.50%,4 次重复的平均值为3.50%,变异系数在15.52% ~ 19.25%,表明茶叶咖啡碱含量在不同年份与季节都是相对稳定的。经PCR 扩增、测序和序列多态性分析, TIDH3 中的一个759 bp 片段的总核苷酸多样性指数πT 和θW 分别为0.006 和0.012,同义突变多样性πsyn = 0.009 大于非同义突变多样性π_nonsyn = 0.006。Ka/Ks = 0. 600 ＜ 1,认为TIDH3 基因受到负向选择作用。 TIDH3 基因连锁不平衡分析表明,基因内的连锁不平衡衰减速度较快,在约300 bp 范围内r² 值降低到了 0.2。通过关联分析,获得两个与咖啡碱含量显著相关的SNP 位点,遗传贡献率分别为10.43%和5.68%。     

与桃果实非酸/酸性状连锁AFLP特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从京玉、美味正反交F1代69株群体中筛选到3个特异扩增片段,与桃果实非酸/酸性状紧密连锁。回收特异片段并将其克隆、测序,结果表明特异片段A、B、C均来自于EcoRI与MseI两内切酶酶切片段,大小依次为140、199、408bp,利用序列分析软件推测片段B、C中可能含有与糖水平调控作用相关的因子。上述结果对AFLP标记向SCAR标记的转换具有重要意义。     

阿月浑子性别鉴定的RAPD分析

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对新疆阿月浑子(PistaciaveraL.)地方品种雌、雄株进行性别鉴定的研究。通过叶片总DNA抽提、RAPD标记分析及反复的试验筛选,找到了一个适用于新疆阿月浑子的RAPD反应体系和循环参数。采用OPO08引物对雌、雄株基因组DNA扩增出性别之间差异性的核苷酸片段,证实雄性植株DNA的扩增产物有一条大约700bp的特异性条带,而雌性植株则无此特异性条带。即找到一条与阿月浑子性别相关的基因标记,表明RAPD技术可应用于新疆阿月浑子地方品种的性别鉴定。此研究是对我国雌雄异株果树阿月浑子在分子水平进行早期性别鉴定的一个尝试。     

番茄育种后代Mi抗性基冈植株的筛选

根据已报道的番茄抗根结线虫病Mi基因的CAP标记设计引物,通过微量DNA提取方法提取番茄叶片的DNA.在优化DNA提取方法和PCR反应条件的基础上,对番茄育种后代共306株试材进行抗性标记筛选鉴定。其中264株无PCR扩增产物,即无抗根结线虫病基因位点,其余42株均产生了750 bp的特异片段,即具有抗根结线虫病基因的位点。利用CAP标记,经TaqI酶酶切,有3株产生了570 bp和160 bp二条特异带,为抗性纯合体;8株产生了750 bp,570 bp,160 bp三条特异带,为抗性杂合体。31株不能被TaqI酶消解,只有未消解前750 bp一条带,为感病植株。     

牡丹Ty3-gypsy 类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

 根据Ty3-gypsy反转录转座子反转录酶的保守序列设计简并引物,从中原牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）品种‘洛阳红’和野生种卵叶牡丹（Paeonia qiui Y. L. Pei et D. Y. Hong）中扩增出430 bp左右的目标片段。目的条带经回收、克隆、测序及相关生物信息学软件进行序列分析后,获得了13条来自牡丹的Ty3-gypsy反转录转座子反转录酶序列。这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为缺失突变,序列长度变化范围为412 ~ 446 bp,同源性范围为71.5% ~ 94.8%。翻译成氨基酸后,有12条序列出现1 ~ 9个不同程度的终止密码子突变,3条序列出现移框突变。其核苷酸序列经过系统聚类后可分为6个家族。将其氨基酸序列与已登录的不同物种Ty3-gypsy反转录转座子反转录酶的氨基酸序列进行聚类分析,结果表明与其他植物具有较高的同源性,表明它们间可能存在着Ty3-gypsy反转录转座子的横向传递。     

Screening of CYP21 gene P459H mutation by PCR-ACRS

AIM:To investigate the frequency of P459H (CCC→CAC) in exon 10 of CYP21 gene among normal population. METHODS:The exons 3-10 of CYP21 gene were amplified with polymerase chain reaction (PCR). The PCR round products were digested by restriction enzyme Pst I to confirm that CYP21 gene was specifically amplified. PCR-based amplification-created restriction site (PCR-ACRS) was performed using the first round PCR products as template. After the second PCR products were digested by restriction enzyme Fsp I, 10% polyacrylamide gel electrophoresis was used to screen the frequency of P459H in exon 10. RESULTS:The codon 459 in exon 10 of CYP21 gene was all CCC among 100 normal cases tested. CONCLUSION:P459H (CCC →CAC) of CYP21 gene might be a novel point mutation causing CAH. Furthermore, PCR-ACRS was a fast and safe method for gene mutation screening.